DESENVOLVIMENTO DE UM MÉTODO DE ELISA PARA A DETECÇÃO DE ROTAVÍRUS A PARTIR DE MATERIAL FECAL

DEVELOPMENT OF AN ELISA METHOD FOR DETECTION OF ROTAVIRUS FROM STOOL SPECIMENS

RESUMO

Um método de ELISA policlonal tipo “duplo-sanduíche” foi desenvolvido para a detecção de rotavírus a partir de material fecal. A amostra NCDV de rotavírus do sorogrupo A foi concentrada por ultracentrifugação utilizando-se um colchão de sacarose a 45% (v/v), e inoculada em coelhos e carneiros. Em seguida, a fração IgG oriunda dos soros dos animais foi purificada por cromatografia de troca iônica e absorvida, utilizando-se polímero de glutaraldeído, de modo a eliminar reações inespecíficas. A presença dos rotavírus foi detectada pela IgG de carneiro e revelada pela IgG de coelho, usando-se IgG de cabra anti-IgG de coelho conjugada à peroxidase. Aplicado a um painel constituído de 86 amostras fecais diarréicas de leitões obteve-se 100% de sensibilidade; 98,79% de especificidade, com uma concordância de 98,83%, tendo como prova padrão a eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE). As variâncias entre 86 repetições da mesma amostra foram 0,001 (para a amostra positiva) e 0,0002 (para a amostra negativa). Estes resultados demonstram que este ELISA constitui-se numa alternativa sensível e específica para o diagnóstico de rotavírus a partir de material fecal.

PALAVRAS-CHAVE:
Rotavírus; diarréia; PAGE; ELISA.

ABSTRACT

There was developed a polyclonal “double-sandwich” antibody ELISA method for detection of rotavirus from stool specimens. The NCDV strain of rotavirus group A was concentrated by ultra-centrifugation using a 45% (v/v) saccharose cushion and inoculated in rabbits and sheep. After that, the IgG of serum samples of the animals was purified by ion-exchange chromatography and absorbed with whole serum of both animal species using a glutaraldehyde polymer, in order to eliminate unspecific reactions. The presence of rotavirus was detected by the sheep’s IgG and revealed by the rabbit’s IgG, using an anti-rabbit IgG peroxidase conjugate developed in goats. When applied in population of 86 fecal samples from piglets with diarrhea, the results of the ELISA were: 100% of sensivity; 98.79% of specificity, with an agreement of 98.83%, using as standard the polyacrilamide gel electrophoresis (PAGE) test. The variances between 86 repetitions of the same sample were 0.001 (for one positive sample) and 0.0002 (for one negative sample). These results showed that this ELISA is a sensitive and specific alternative test for rotavirus diagnosis from fecal material.

KEY WORDS:
Rotavirus; diarrhea; PAGE; ELISA.

INTRODUÇÃO

As diarréias em animais representam uma das principais causas de morbi-mortalidade do período neonatal (SCHUDEL et al., 1985), caracterizada como uma síndrome de grande complexidade etiológica, que conta com a influência de alterações ambientais, manejo, fatores nutricionais e fisiológicos, os quais cooperam para o agravamento dos quadros (SNODGRASS et al., 1986).

Dentre os agentes virais causadores de diarréias em animais jovens de várias espécies, os rotavírus do sorogrupo A são identificados mundialmente, assumindo particular importância em termos de seu potencial zoonótico e prevalência (ESTES, 1996), tendo sido descritos no Brasil em diversas propriedades de criação de bovinos e suínos (ALFIERI et al., 1994; BUZINARO & JEREZ, 1998; GATTI et al., 1989; JEREZ et al., 1989; LANGONI, 1988).

Para o controle das rotaviroses é primordial a identificação precisa do agente em surtos de diarréia de modo a se estabelecerem medidas profiláticas direcionadas e, nesse sentido, foi desenvolvido um método de ELISA policlonal tipo “duplo-sanduíche” para o diagnóstico direto de rotavírus do grupo A, a partir de material fecal, utilizando-se IgG de carneiro anti-rotavírus como anticorpo de captura, IgG de coelho anti-rotavírus como anticorpo revelador, e IgG de cabra anti-IgG de coelho conjugada à peroxidase.

MATERIAL E MÉTODOS

Utilizou-se a amostra NCDV (Nebraska Calf Diarrhea Virus) de rotavírus bovino do grupo A, sendo propagada em células de linhagem MA-104, e concentrada por ultracentrifugação (ultracentrífuga Beckman^R L8-70M) a 100.000 g por 3 horas, utilizando-se um “colchão” de sacarose a 45% (p/v) em tampão TRIS 0,1M/CaCl₂ 1,5 mM pH 7,3.

Para o preparo do anticorpo de captura, 2 carneiros foram inoculados 4 vezes com intervalo de 21 dias entre cada inoculação pela via subcutânea, utilizando-se 100 µg de NCDV concentrado e adjuvante Avridine^R, na proporção de 1 parte de adjuvante para 17 partes de antígeno (v/v). Para o preparo do anticorpo revelador, foram inoculados 4 coelhos, em procedimento semelhante ao dos carneiros, mas cada um recebendo 50µg de NCDV concentrado por inoculação. Posteriormente, colheu-se o sangue dos animais e elaboraram-se “pools” para a precipitação da fração gamaglobulínica do soro hiperimune com sulfato de amônio (HERBERT et al., 1973). As frações IgG foram purificadas por cromatografia de troca iônica à base de DEAE-celulose (CORTHIER et al., 1984). Visando assegurar a especificidade dos anticorpos de captura e revelador, eles foram absorvidos, respectivamente, com polímeros produzidos com glutaraldeído utilizando-se soro total de coelho e soro total de carneiro, segundo técnica descrita por TERNYNCK & AVRAMEAS (1976), e avaliando-se os resultados por 3 ensaios de ELISA tipo “duplo sanduíche”, utilizando-se microplacas (Nunc Maxisorp^R) sensibilizadas com 10 µg/mL de anticorpo de captura, frente ao anticorpo revelador diluído a 1:100, conjugado (Sigma Imunochemicals^R A-6154) diluído a 1:1000, e leitura utilizando-se filtro de 492 nm.

As amostras fecais diarréicas de leitões foram testadas quanto à presença de rotavírus segundo a prova de eletroforese em gel de poliacrilamida - PAGE (HERRING et al., 1982). Na fase inicial de padronização do ELISA foi realizada a titulação em bloco dos reagentes e amostras fecais (13 positivas e 13 negativas) visando determinar as suas diluições de uso. Adotou-se a combinação de reagentes que produziu maior valor de absorvância para as amostras positivas e também a maior diferença entre as médias das absorvâncias das amostras positivas e negativas. Com base nesta combinação, a média das absorvâncias das amostras positivas foi subtraída de 2 desviospadrão e os valores superiores ou iguais a este foram considerados positivos.

O ELISA foi então aplicado a um painel constituído por 86 amostras fecais diarréicas de leitões. Foram feitas suspensões a 10% em PBS 0,01M pH 7,4 das amostras fecais, posteriormente clarificadas por centrifugação a 2.000 g por 15 minutos a 4ºC. O tampão empregado na diluição das amostras fecais, do anticorpo revelador e do conjugado consistiu em PBS 0,01M pH7,2/Tween 80 a 0,5% / leite em pó desnatado a 5%. A cada passo da reação de ELISA foram efetuadas 3 lavagens das microplacas com tampão PBS 0,01M pH7,2/Tween 80 a 0,5%.

As microplacas foram sensibilizadas com anticorpo de captura em concentração de 10 µg/mL em tampão carbonato-bicarbonato 0,05M, pH 9,6, em volume de 100µL por cavidade e mantidas em incubação a 4ºC por 18 h. Em seguida, foram bloqueadas com tampão carbonato-bicarbonato 0,05M, pH 9,6 com 10% de leite em pó desnatado, sendo incubadas a 4ºC por 1 hora. Adicionou-se cada amostra fecal tratada diluída a 1:4 (v/v), em duplicata, incubando-se a 37ºC por 1 hora. O anticorpo revelador foi diluído a 1:100 (v/v) e utilizado em volume de 100 µl por cavidade. Após incubação a 37 ºC por 1 hora, adicionou-se o conjugado na diluição de 1:1000 (v/v) diluído em tampão de diluição, em volume de 100 µL por cavidade e incubaram-se as placas a 37ºC por 1 hora. Empregou-se a ortofenilenodiamina (OPD) como solução cromógena, em tampão citrato-fosfato pH 5,0, acrescida de 0,012% de peróxido de hidrogênio. Decorridos 10 minutos após a adição do substrato, adicionou-se a solução de bloqueio, HCl 1N, em volume de 50µL por cavidade.

As placas foram lidas em aparelho leitor de placas Labysystem^R modelo Multiskan plus, com filtro de 492 nm. Os valores de absorvância obtidos foram expressos pela média aritmética entre a duplicata de cada amostra, e calcularam-se os valores de sensibilidade, especificidade e concordância relativas. Visando avaliar a reprodutibilidade do ELISA, selecionou-se ao acaso duas amostras fecais, sendo uma positiva e outra negativa para rotavírus pela técnica de PAGE. Cada amostra foi testada por 86 vezes distribuídas em 2 placas diferentes, de modo a se estabelecer a variância entre as repetições.

RESULTADOS

No ensaio de ELISA visando verificar a presença de reatividade entre os anticorpos captura e revelador, sem que estes tivessem sido absorvidos frente aos seus respectivos polímeros, observou-se uma densidade óptica de 1,179; posteriormente, ao se absorver apenas o anticorpo de captura, houve uma redução para o valor de 0,380 e, ao se absorverem ambos os anticorpos, foi possível reduzir este valor a 0,053, permitindo, assim, o emprego dos anticorpos captura e revelador elaborados anteriormente.

Os valores médios de densidades ópticas obtidas com o ensaio de ELISA na etapa de padronização encontram-se na Tabela 1.

Tabela 1
Valores médios de densidades ópticas obtidas com o ensaio de ELISA tipo “duplo sanduíche” utilizando amostras fecais negativas e positivas ao PAGE, frente a diversas diluições do anticorpo revelador e sensibilização da placa com 10 µg/mL do anticorpo de captura. Leitura realizada com filtro de 492 nm, São Paulo, 1998.

	Amostras	positivas	Amostras	negativas
Revelador	1:4	1:12	1:4	1:12
“1:100”	0,587	0,479	0,046	0,041
“1:200”	0,459	0,381	0,036	0,040
“1:400”	0,371	0,315	0,077	0,071
“1:800”	0,227	0,183	0,028	0,027
“1:1600”	0,166	0,147	0,029	0,046

Em função de tais resultados, adotou-se nas etapas subseqüentes a concentração do anticorpo de captura de 10 µg/mL, diluição da amostra fecal de 1:4, e diluição de anticorpo revelador de 1:100. Com base na combinação escolhida dos reagentes, a padronização apresentou média aritmética das densidades ópticas entre todas as amostras positivas de 0,587 e desvio padrão de 0,158. Logo, as amostras que apresentaram valor maior ou igual a 0,271 foram consideradas como sendo positivas.

Na Tabela 2 é apresentada a classificação das amostras fecais testadas com a prova de ELISA “duplo sanduíche”, tomando como referência a prova de PAGE. Neste sentido, obteve-se uma sensibilidade relativa do ELISA de 100%; especificidade relativa de 98,79%; e concordância relativa de 98,83%.

Tabela 2
Classificação das amostras fecais segundo a prova de ELISA “duplo sanduíche”, tendo como referência a prova de eletroforese em gel de poliacrilamida, São Paulo, 1998.

ELISA	PAGE		Total
	Positivo	Negativo
Positivo	3	1	4
Negativo	0	82	82
Total	3	83	86

A avaliação da reprodutibilidade de 86 repetições de uma amostra positiva e 86 repetições de uma amostra negativa, segundo a prova de ELISA “duplo sanduíche”, apresentou média das densidades ópticas de 0,483 e 0,077 e desvio padrão de 0,036 e 0,016, respectivamente, para a amostra positiva e negativa. A variância foi de 0,001 para a amostra positiva e de 0,0002 para a negativa.

DISCUSSÃO E CONCLUSÕES

Vários testes têm sido empregados no diagnóstico dos rotavírus, incluindo PAGE (HERRING et al., 1982), ELISA (YOLKEN et al., 1978; ELLENS & LEEUW, 1977; BELLAMY et al., 1983; PEREIRA et al., 1985) e a reação em cadeia pela polimerase (PCR) (GOUVEA et al., 1990).

Como qualquer outra reação sorológica, na reação de ELISA há uma dependência direta da qualidade dos anticorpos empregados. Foi possível a utilização dos anticorpos de captura e revelador, produzidos a partir de soro de animais inoculados com o vírus concentrado apenas em colchão de sacarose, sem a necessidade de purificá-los com gradiente de cloreto de césio como descrito anteriormente por PEREIRA et al. (1985).

Uma das limitações na elaboração de um ELISA é a presença freqüente de ruídos e reações inespecíficas (CROWTHER, 1995). Através do emprego de polímeros de proteínas insolúveis como imunoadsorventes, à base de glutaraldeído, reduziu-se substancialmente a intensidade de reações inespecíficas entre os anticorpos de captura e revelador, o que assegurou sua especificidade restrita aos rotavírus. Tal fato torna-se particularmente relevante no ELISA tipo “duplo-sanduíche”, pois, além da possível interação entre os anticorpos captura, revelador e conjugado como pudemos observar, o uso de fezes como amostra, dada a sua composição diversa, pode potencialmente proporcionar o aparecimento de tais reações.

O ponto de corte adotado implicou valores de sensibilidade relativa de 100%; especificidade relativa de 98,79% e concordância de 98,83%, quando comparada à PAGE. Os valores de variabilidade, dados em função das variâncias apresentadas, foram 0,1% para a amostra positiva e 0,02% para a amostra negativa e, portanto, este componente não influenciou substancialmente nos resultados de leituras entre placas.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  30 Set 2024
• Data do Fascículo
  Jul-Dec 2000

Histórico

• Recebido
  26 Maio 2000