ESTUDO COMPARATIVO DOS TESTES 2-MERCAPTOETANOL E REAÇÃO DE FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO NO SORODIAGNÓSTICO DA BRUCELOSE BOVINA

COMPARATIVE STUDY OF 2-MERCAPTOETHANOL AND COMPLEMENT FIXATION TEST IN BRUCELLOSIS DIAGNOSIS IN BOVINE SERUM

RESUMO

O presente estudo teve como objetivo comparar o teste do 2-Mercaptoetanol (2-ME) em relação à reação de fixação do complemento (RFC') no sorodiagnóstico da brucelose, ambos escolhidos como confirmatórios pelo Programa Nacional de Combate à Brucelose Bovina do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento no Brasil. Para tanto, foram processadas 77 amostras de soro de fêmeas bovinas vacinadas, com idade igual ou superior a 24 meses (grupo A) e 74 amostras de soro de fêmeas de bovinos não vacinadas (grupo B), totalizando 151 animais pertencentes a diferentes tipos de exploração e procedentes de cinco estados brasileiros. Foram identificados, através da RFC', 40,2% de animais reatores e 35,1% para o grupo B. O teste estatístico utilizado para analisar os resultados foi o de MCNEMAR, com intervalo de confiança de 5%, não havendo diferença estatística significativa entre os mesmos. O teste KAPPA foi usado como medida de concordância entre as provas e o resultado foi de 91,9% para o grupo A e 88,5% para o grupo B. Baseados nos dados, calculou-se a sensibilidade, a especificidade e a concordância do 2-ME em relação à RFC', teste padrão para a doença. Observou-se sensibilidade do 2-ME de 96,8% e 100% e especificidade 95,6% e 91,7%. Conclui-se que o 2-me é um ótimo teste confirmatório no sorodiagnóstico da brucelose bovina, revelando, também neste trabalho, possuir boa sensibilidade.

PALAVRAS-CHAVE:
Brucelose bovina; 2-Mercaptoetanol; reação de fixação do complemento; sorodiagnóstico.

ABSTRACT

The objective of the present study was to compare two tests commonly applied in brucellosis diagnosis in bovine serum, 2-Mercaptoethanol (2-ME) and Complement Fixation Test (RFC'). Both tests have been chosen as confirmatory means by the National Program Against Bovine Brucellosis of the Brazilian Agriculture Ministry [Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento]. In the trial, 77 serum samples from vaccinated female bovines (group A), 24 months old or older, and 74 samples from non-vaccinated females (group B) were analyzed. These 151 samples came from five Brazilian states. RFC’ identified 40.2% reactor animals for group A and 35.1% for group B. Statistical comparison of the results was performed by the MCNEMAR test, with a 5% confidence interval. There was no statistically significant difference between the results. The KAPPA test was used as an agreement measure between the tests and the result was 91.9% for group A and 88.5% for group B. Based on these data, the sensitivity, specificity, and agreement between 2-ME and RFC' were analyzed. Sensitivity of 2-ME was 96.8% and 100%, and specificity was 95.6% and 91.7%. The 2-ME test is a good confirmatory test for the serological diagnosis of the bovine brucellosis, besides presenting adequated sensitivity, as seen in this trial.

KEY WORDS:
Bovine brucellosis; 2-Mercapthoetanol; Complement Fixation Test; serum diagnosis.

INTRODUÇÃO

O desenvolvimento de novas técnicas para o aperfeiçoamento do sorodiagnóstico não necessariamente resulta em testes mais adequados do que os já existentes, devendo-se considerar a aplicação daqueles já pertencentes ao sorodiagnóstico convencional e que muitas vezes não foram devidamente explorados. Existem bons testes já consagrados para o diagnóstico da doença, como a reação de fixação do complemento (RFC') e os relativamente novos, como os imunoenzimáticos ou o teste de polarização fluorescente (DAJER, 1999), mas que, em geral, não podem ser aplicados em pequenos laboratórios devido ao elevado custo inicial a ser empregado na sua implantação, além da necessidade de treinamento de pessoal capacitado. Desta forma, deve-se utilizar da melhor maneira possível os testes disponíveis, como o teste do 2Mercaptoetanol (2-ME), que apresenta baixo custo, validade e simplicidade na sua execução (ALTON, 1975).

No lançamento do Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e Tuberculose (PNCEBT) no Brasil, em 11 de janeiro de 2001, foi previsto que os médicos veterinários e laboratórios fossem credenciados para que pudessem realizar o sorodiagnóstico da brucelose. Foram preconizados o

2-ME e a RFC' como provas confirmatórias (BRASIL, 2001). Por este motivo, o presente trabalho propõe analisar a acurácia destes dois testes, principalmente, a do 2-ME, utilizando a RFC' como prova padrão.

As diferenças nos desempenhos dos testes clássicos baseiam-se, sobretudo, nos anticorpos detectáveis. Assim sendo, a quantidade (em µg/mL) de isotipos de IgG contra B. abortus necessária para causar sinal nos testes clássicos usados no sorodiagnóstico da brucelose bovina difere, sendo o ELISA IND. e a RFC' os testes com limiar de detecção mais baixos (ALLAN, 1976; WRIGHT & NIELSEN, 1990).

A análise dos resultados dos testes, principalmente, em situações onde a prevalência da doença é baixa deve ser feita com critério. Num estudo analítico dos resultados, o falso positivo ocorre principalmente devido à detecção de IgM. As reações antígenoanticorpo específicas para a doença são caracterizadas pela detecção da IgG₁ que, embora bivalente, é muito ávida devido à alta afinidade pelos epítopos bacterianos (FERRI et al., 1977).

A SLT, executada em pH neutro, demonstra alta sensibilidade analítica na detecção dos isotipos bovinos com uma exceção importante: a IgG₁ (WRIGHT & NIELSEN, 1990). ALTON (1978) refere que a SLT, em vários experimentos, demonstrou sensibilidade e especificidade baixas em relação a outros testes convencionais. Assim, os soros são tratados visando eliminar a atividade aglutinante da IgM, com o objetivo de aumentar a especificidade da SLT.

O teste do antígeno acidificado tamponado (TAAT) foi desenvolvido a partir da observação de que a IgG₁ bovina é menos ativa em pH neutro, mudando o seu comportamento bioquímico em meio ácido. Assim sendo, o pH 3,65 ± 0,05 aumenta o poder de aglutinação da IgG₁, reduz a reatividade da IgM e destrói aglutininas inespecíficas (WRIGHT & NIELSEN, 1990; BISHOP et al., 1994). NICOLETTI (1969) demonstrou que o TAAT detectou 95% de animais positivos ao exame direto. HUNTER & ALLEN et al. (1972), ao compararem diferentes provas sorológicas, constataram que o TAAT detectou o maior número de reatores positivos ao exame direto. Entretanto, como se trata de um processo físico (acidificação do meio), é provável que nem todas as IgM tenham sua reatividade reduzida. ALLAN et al. (1976) concluíram que o teste também detecta IgM.

O 2-ME e a RFC' fundamentam sua especificidade de forma diferenciada: o 2-ME inativa a atividade aglutinante da IgM mediante processo químico, reduzindo as pontes dissulfídricas da sua estrutura pentamérica, degradando-a em cinco sub unidades não aglutinantes (FERRI et al., 1977; TIMONEY et al., 1988). Essas sub unidades conservam suas características de antigenicidade, mas deixam de ser anticorpos plurivalentes e passam a se comportar como anticorpos univalentes. Ainda que as sub unidades estejam integradas por suas cadeias pesadas e leves, ao combinarem-se com o antígeno não originam complexos suficientemente grandes para provocarem o fenômeno da aglutinação, provavelmente devido a algum impedimento estérico em conseqüência de sua nova conformação espacial (FERRI, et al., 1977).

O 2-ME detecta tanto IgG₁ como IgG₂ (NIELSEN, 1984). Embora a tendência analítica a favor da detecção da IgG₁ sobre a IgG₂ não seja tão grande quanto nos testes tamponados, é interessante notar que o tratamento com o 2-ME provoca aumento na sensibilidade do teste, pela promoção da reatividade de IgG₁, aumentando a tendência em detectá-la, enquanto que a reatividade da IgG₂ está reduzida (NIELSEN & DUNCAN, 1990; WRIGHT & NIELSEN, 1990). Provavelmente o fenômeno ocorra devido ao pH ácido (5,5) que a droga proporciona ao meio contendo soro e 1 mL de 2-ME a 0,714% (ALTON, 1975; BADEN, 2002). Desta maneira, embora haja antagonismo que rege a especificidade e sensibilidade nos testes em geral (ou seja, o aumento da especificidade promove a diminuição da sensibilidade e vice-versa), no 2-ME esta condição nem sempre ocorre.

NIELSEN et al., (1995) citam a IgG₁ como único anticorpo detectado no RFC' em bovinos, o que eleva a especificidade do teste e não chega a interferir no seu desempenho, pois a detecção de IgG₁ compensa a restrição da IgG₂, além da resposta de IgG₁ ser predominante sobre IgG₂ em animais naturalmente infectados (WRIGHT & NIELSEN, 1990). O Código Zoosanitánio Internacional da OIE refere a RFC' como importante suporte técnico, além de ser o teste exigido pelo comércio internacional de animais e produtos de origem animal (OIE, 2002).

Na RFC', o excesso ou predominância de IgG₂ pode induzir o fenômeno de prozona e reações falso negativas. Não está muito claro quais as causas desse fato, mas as sugeridas são: idade avançada do animal, exposições repetidas ao agente, condições ambientais levando a estresse e a transferência ativa de IgG₁ para o colostro no período peri-parto (CHAPPEL, 1989). BRANDON et al. (1971) também referem-se ao mecanismo fisiológico de transferência ativa de IgG₁ para o colostro neste período, fazendo com que a concentração de IgG₁ circulante não seja suficiente para propiciar o sinal. Conforme afirmaram TIMONEY et al. (1988) a IgG₂ bloqueia competitivamente o acesso de IgG₁ ao antígeno, na RFC'. Ainda que a IgG₂ não fixe complemento, reage normalmente com o antígeno, gerando o prozona. O resultado é uma reação falso negativa. Nesses casos, o 2-ME tem importante papel na análise final do sorodiagnóstico da amostra em estudo.

MATERIAL E MÉTODOS

Amostras: foram processadas 151 amostras de soro de fêmeas de bovinos com idade entre 36 e 60 meses, não levando em consideração a forma de criação de exploração econômica, procedentes de cinco estados brasileiros. Todos os soros foram submetidos às duas provas (2-ME e RFC'). Executou-se primeiro o 2-ME seguido da RFC', para preservar o protocolo do 2-ME, que não prescreve a inativação do soro. Os animais foram divididos em dois grupos: Grupo A: 77 soros de animais vacinados com a amostra viva de B. abortus estirpe B19. Grupo B: 74 soros de animais não vacinados.

Antígeno: utilizou-se para o 2-ME, para a RFC' e para a soroaglutinação lenta em tubos (SLT) o mesmo antígeno com concentração de massa bacteriana de 4,5%, sem corante, padronizado a partir da cepa 1119-3 de Brucella abortus inativada pelo calor, produzido no Instituto Biológico de São Paulo, de acordo com o protocolo descrito pelo CENTRO PANAMERICANO DE ZOONOSES (1969).

Testes: O 2-ME foi executado e interpretado conforme ALTON et al. (1975) e para permitir melhor análise comparativa, objeto deste trabalho, a escala de diluição do soro estendeu-se até 1:400. O teste foi considerado como reator de acordo com a tabela do

PNCEBT, executado junto com a SLT (BRASIL, 2001).

A execução RFC' a quente em microplaca, assim como a titulação da hemolisina, complemento e antígeno foram feitos de acordo com a técnica descrita por ALTON (1988). Utilizou-se soro de cobaio como complemento e antisoro de coelho como hemolisina. As reações foram executadas em placas de polistireno de fundo em "U" com 25 µL de soro a uma diluição inicial de dois, com igual volume de antígeno e soro de cobaio, contendo cinco unidades de complemento capazes de hemolisar 50% das hemácias de carneiro sensibilizadas pela hemolisina (sistema hemolítico). Após a placa ser incubada por 30 minutos em estufa bacteriológica a 37º C, o mesmo volume de sistema hemolítico foi colocado, incubando-se novamente a placa por mais 30 minutos. O título do soro foi obtido determinando a recíproca da sua diluição, onde ocorreu fixação de 50% de complemento. Converteu-se o resultado em Unidades Internacionais de acordo com a técnica padronizada no Laboratório Central de Veterinária em Weybridge, Reino Unido, que considera positivos soros com títulos iguais ou acima de 20 UI (MINISTRY OF AGRICULTURE, 1978). Empregou-se uma escala de lise para a leitura das reações (grau de hemólise).

Os testes foram executados contemporaniamente utilizando a interpretação em série, visando o aumento de especificidade - valor preditivo positivo (TRUSFIELD, 1986).

Análise estatística: para verificar se houve independência entre o resultados das duas provas, utilizou-se o teste de McNemar, considerando os resultados como reatores e não reatores aos testes (MACLURE & WILLET, 1987). O teste KAPPA foi usado como medida de concordância entre testes sob condição real de acordo com TRUSFIELD, 1986.

RESULTADOS

GRUPO A: Animais vacinados

O resultado do teste aplicado mostra que houve concordância de 96,1% entre o 2-ME e a RFC' (74/77). A sensibilidade encontrada foi de 96,8% e a especificidade 95,6% (Tabela 3). O estudo identificou 40,2% (31/77) de animais positivos para brucelose na prova de RFC'. Aplicando-se o teste de McNemar para um intervalo de confiança de 5% obteve-se p = 1.000, não havendo diferença estatística significativa entre os resultados discordantes dos dois testes, mostrando independência entre os mesmos. A concordância ao teste KAPPA obtida foi de 91,9%. Os resultados obtidos no 2-ME comparado com a RFC' podem ser observados na Tabela 1.

Tabela 1
Resultado da prova do 2-ME e a RFC' para o sorodiagnóstico da Brucella abortus em 77 amostras do grupo A: animais vacinados.

Idade	2-ME	RFC'
		Negativos					Positivos
36 a 60 meses	*não reatores	nr.*	0 a <20	total	≥20 a 106,4	>106,4 a 212,8	>212,8 a 425,6	>425,6 a 851,2	>851,2	total	total
		42	02	44 (d)	01					01 (c)	45
	reatores 1:25	02
	1:50 i									04	04
	1:100 i									07	07
	1:100									03	03
	1:200 i					01				01	01
	1:200 1:400 i							01		01	01
	≥ total de reatores	02	00	02 (b)	14	02	03	04	07	30 (a)	32
	Total	44	02	46	15	02	03	04	07	31	77

• ^*
  Não reagente
• ^**
  Ocorrência do fenômeno de prozona em três amostras (positivando no título 1:400).
• ^***
  Ocorrência do fenômeno de prozona em duas amostras (positivando no título 1:400).

Tabela 2
Resultado da prova do 2-ME e a RFC' para o sorodiagnóstico da Brucella abortus em 74 amostras do grupo B: animais não vacinados.

Idade	2-ME	RFC’								total
		Negativo			Positivos
		nr.*	0a<20	total	>20 a 106,4	>106,4 a 212,8	>212,8 a 425,6 >425,6 a 851,2	>851,2	total	total
	não reatores	44		44 (d)					00(c)	44
36 a 60 meses	reatores 1:50 1:100 1:200 i 1:200	01	01 02	02 02	02 04 01 06	05	03	05	02 04 01 19	04 06 01 19
	total de reatores	01	03	04 (b)	13	05	03	05	26 (a)	30
Total		45	03	48	13	05	03	05	26	74

• ^*
  nr.: Não reagente

GRUPO B: Animais não vacinados

O resultado do teste aplicado mostra concordância de 94,6% entre a 2-ME e a RFC’. A sensibilidade encontrada foi de 100% e, a especificidade, 91,7% (Tabela 3). O estudo identificou 35,1% (26/74) de animais reatores para brucelose na prova de RFC’. Aplicando-se o teste de MCNEMAR para um intervalo de confiança de 5% obteve-se p= 0,3711, não havendo diferença estatística significativa entre os resultados discordantes dos dois testes, mostrando independência entre os mesmos. A concordância ao teste KAPPA obtida foi de 88,5%. Os resultados obtidos no 2-ME comparado com a RFC’ podem ser observados na Tabela 2.

Tabela 3
Valores epidemiológicos relativos obtidos das respostas ao 2-ME nos soros reatores à brucelose, usando o teste de RFC' como referência. Grupo A (animais vacinados) e Grupo B (animais não vacinados).

		valores epidemiológicos relativos - Grupo A
	prevalência real	sensibilidade	especificidade	concordância	falso positivo	falso negativo
	31/77	30/31	44/46	74/77	2/46	1/31
2-ME x RFC' %	40,3	96,8	95,6	96,1	4,4	3,2
		valores epidemiológicos relativos - Grupo B
	prevalência real	sensibilidade	especificidade	concordância	falso positivo	falso negativo
	26/74	26/26	44/48	70/74	4/48	0/28
	35,1	100	91,7	94,6	8,3	0

DISCUSSÃO

A RFC' é considerada a melhor prova de sorodiagnóstico para a confirmação da brucelose, apresentando a melhor correlação com os isolamentos em animais natural ou experimentalmente infectados (NIELSEN, 1995). A variação da RFC' a quente, utilizada neste estudo, é mais prática, diminui as reações anticomplementares e elimina a IgM, aumentando a especificidade do teste (CHAPPEL, 1989). A técnica detecta precocemente IgG₁ no soro, em torno do 14º dia (HILL, 1963) e também, devido ao seu baixo limiar de detecção, é capaz de revelar casos crônicos, onde a IgM já desapareceu a IgG₁ está em baixa concentração (KRUZE, 1975).

Os testes 2-ME e a RFC' têm alta especificidade na detecção de anticorpos anti Brucella abortus (UZAL et al., 1995; NIELSEN, 1995), desempenhando papel fundamental na validação do sorodiagnóstico da brucelose bovina, porque confirmam o resultado das provas de triagem (DAJER et al., 1999). Dessa maneira, a utilização de um bom teste confirmatório pode evitar o sacrifício de animais sãos (WRIGHT & NIELSEN, 1990).

NICOLETTI (1969) relatou concordância entre o 2-ME e a RFC', cerca de 97%, ratificando os resultados encontrados neste estudo, já que a concordância obtida ao teste KAPPA foi de 91,9% (grupo A) e 88,5% (grupo B) e os valores obtidos na Tabela 3.

Observou-se sensibilidade do 2-ME de 96,8% e 100% e especificidade 95,6% e 91,7% (Tabela 3), valores semelhantes à literatura consultada: sensibilidade de 89,6% (POESTER et al., 1998) e especificidade de 97,0% (NICOLETTI & MURASCHI, 1966), 93,1% (POESTER et al., 1998) e 89,37% (UZAL et al., 1998).

A obtenção de dois reatores ao 2-ME e não reatores à RFC', neste estudo, sugere a detecção de IgG₂ no primeiro teste, porém não detectável no segundo (LEVIEUX, 1973; QUINN et al., 1984). A ocorrência de fenômeno de prozona (FERRI et al., 1977) somente no RFC' também sugere a não detecção da IgG₂ pelo 2-ME. Se por um lado a promoção da reatividade da IgG₁ e a detecção tanto de IgG₁ quanto de IgG₂ explique o bom desempenho do 2-ME, na RFC' sobretudo o baixo limiar de detecção para IgG₁ caracterizariam seu excelente desempenho, superando o 2-ME e ratificando a sua utilização como gold standard para a doença.

No Grupo A, comparando-se os resultados obtidos no 2-ME com os da RFC', observa-se que dos 46 não reatores à RFC', 44 também não foram reatores ao 2-ME. Das 32 amostras reatoras ao 2-ME, somente duas foram qualificadas como não reatoras ao RFC', resultando numa percentagem de falsos positivos de 4,4% (2/46). Dos 45 soros não reatores ao 2-ME, todos foram não reatores à RFC', não ocorrendo resultados falsos negativos. Dos 32 soros reatores ao 2-ME, 30 também foram reatores à RFC' e dos 31 soros reatores a esta prova, todos foram reatores ao 2-ME.

Observou-se relação direta crescente entre os títulos positivos apresentados nas duas provas, ou seja, os resultados seguem um padrão dentro da zona de interpretação positiva (Tabela 1): para os reatores na faixa de > 20 a 106,4 na RFC’, 86,7% (13/15) os resultados obtidos ao 2-ME flutuaram entre 1:50i ou 1:100 e 6,7% (1/15), igual ou acima de 1:400. Para a faixa > 106,4 a 212, 50% dos resultados do 2-ME resultaram em um título 1:100 e 50% 1:200. Entre 212,8 e 425,6, os títulos variaram em 1:200i - 33,3% (1/3) e 1:200 - 66,7% (2/3). Para os títulos > 425,6 a 851,2, os títulos variaram entre 1:400i 25% (1/4) e 1:400 75% (3/4). Acima de 851,2, 100% dos títulos obtiveram 1:400 (7/7). Em cinco amostras reatoras ao 2-ME ao título igual ou acima de 1:400 ocorreu o fenômeno de prozona à RFC': três a um título entre > 425,6 e 851,2 e duas num título acima de 851,2 (Tabela1).

Sobre os discordantes, vale lembrar que os dois reatores ao 2-ME e negativos à RFC' tiveram títulos mínimos (1:25), o mesmo ocorrendo com o resultado positivo à RFC' e negativo ao 2-ME (> 20 a 106,4 UI). Os dois soros que reagiram na faixa de 0 a < 20 UI (negativos para a prova) foram não reatores ao 2-ME, sugerindo maior sensibilidade da RFC' em relação ao 2- ME, devido ao seu limiar de detecção ser mais baixo (KRUZE, 1975; SECRETARIA DE AGRICULTURA, 1995). As correlações entre os dois testes são demonstradas na Tabela 1.

No Grupo B, a relação direta crescente entre os títulos positivos apresentados nas duas provas também ocorreu neste grupo: para os reatores na faixa de > 20 a 106,4 na RFC', 46,2% (6/13) dos resultados obtidos ao 2-ME flutuaram entre 1:100i ou 1:100 e 53,8% (7/13) entre 1:200i a 1:200. Para a faixa > 106,4 a 212, 100% dos resultados do 2-ME resultaram em título 1:200 (5/5), o mesmo ocorrendo entre 212,8 e 425, com títulos a 1:200 (3/3) e acima de 851,2, 100% dos títulos deram 1:400 (7/7) - Tabela 2.

Sobre os discordantes, quatro resultados reatores ao 2-ME e negativos à RFC' tiveram títulos que variaram entre 1:50 e 1:100. Três destes soros reagiram na faixa de 0 a < 20 UI (negativos para a prova), sugerindo a presença de IgG₂, que pode ser detectada no 2-ME, mas não na RFC' (NIELSEN et al., 1984). As correlações entre os dois testes são demonstradas na Tabela 2.

CONCLUSÃO

Utilizando a RFC' como técnica padrão para o sorodiagnóstico da brucelose bovina, ratifica-se o 2ME como teste confirmatório e, ainda, que sua aplicação seja para validar os testes de triagem, revelou possuir também boa sensibilidade.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem à Dra. Cláudia Del Fava, Pesquisador Científico do Instituto de Zootecnia, pela sua colaboração na leitura crítica do presente texto.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  20 Set 2024
• Data do Fascículo
  Oct-Dec 2002

Histórico

• Recebido
  28 Ago 2002
• Aceito
  02 Nov 2002