ESTRATÉGIA PARA A DETECÇÃO DE TOSPOVÍRUS^*

STRATEGY FOR DETECTION OF TOSPOVIRUSES

RESUMO

Com o objetivo de desenvolver um método simples, rápido e sensível para a detecção simultânea de espécies de tospovírus presentes no Brasil, foram desenvolvidas sondas radioativas para hibridização via dot blot. As sondas foram sintetizadas a partir de diferentes fragmentos de RT-PCR, obtidos de RNAs totais extraídos de plantas de Nicotiana benthamiana infectadas pelo Tomato spotted wilt virus (TSWV) com oligonucleotídeos específicos para os genes de nucleocapsídeo (N) e polimerase (L). A sonda para o gene N foi vírus específica, sendo detectada somente a espécie TSWV. Quando se utilizou a sonda para o gene L, todas as espécies de tospovírus utilizadas foram detectadas simultaneamente.

PALAVRAS-CHAVE:
TCSV; GRSV; INSV; CSNV; ZLCV; IYSV; hibridização.

ABSTRACT

Radioactive probes were synthesized for the simultaneous detection of tospoviruses by a quick and sensitive dot blot hybridization assay. Total RNA of Tomato spotted wilt virus (TSWV) - infected Nicotiana benthamiana plants was used as template for RT-PCR using sequences of the nucleoprotein (N) and polymerase (L) genes as oligonucleotide primers. Hybridization assays using N gene-derived probes were found to be TSWV-specific, whereas the L gene-derived probe was able to detected all tospoviruses simultaneously.

KEY WORDS:
TCSV; GRSV; INSV; CSNV; ZLCV; IYSV; hybridization.

INTRODUÇÃO

O gênero Tospovirus (família Bunyaviridae) apresenta ampla distribuição mundial, podendo infectar mais de 1050 espécies de plantas em 92 famílias botânicas (PETERS, 1998). Dentro da moderna taxonomia de vírus, várias espécies de tospovírus têm sido propostas (PRINS & GOLDBACH, 1998). No Brasil, já foram relatadas as espécies Tomato spotted wilt virus (TSWV), Tomato chlorotic spot virus (TCSV), Groundnut ringspot virus (GRSV), Chrysanthemum stem necrosis virus (CSNV), Zucchini lethal chlorosis virus (ZLCV) e Iris yellow spot virus (IYSV) (RESENDE et al., 1996; BEZERRA et al., 1999).

Os métodos mais comumente utilizados para detecção de espécies de tospovírus têm sido inoculação mecânica em plantas indicadoras (BEST & GALLUS, 1953), testes sorológicos, com destaque para ELISA (WANG & GONSALVES, 1990; RESENDE et al., 1991; DE ÁVILA et al., 1993) e métodos moleculares como reação em cadeia da polimerase (PCR) (MUMFORD et al., 1996; EIRAS et al., 1998; EIRAS, 1999). As técnicas de hibridização com sondas radioativas têm sido utilizadas para detecção do TSWV por serem métodos rápidos e bastante sensíveis (GERMAN & RICE, 1988; RONCO et al., 1989; HUGUENOT et al., 1990; RICE et al., 1990). CHO et al. (1989) utilizaram “dot-blot” para detecção do TSWV em pimenta (Capsicum sp.) no Havaí, onde o teste apresentou sensibilidade equivalente à ELISA. RICE et al. (1990), utilizando hibridização com sonda radioativa de cDNA, detectaram TSWV através de “dot-blot”, tanto em plantas infectadas, como no próprio tripes vetor.

Com o objetivo de se obter um método para a detecção simultânea das espécies do gênero Tospovirus que ocorrem no Brasil, foram sintetizadas sondas moleculares radioativas, a partir de produtos amplificados via RT-PCR (“reverse transcriptase-polymerase chain reaction”) de diferentes regiões do genoma viral, para hibridização com RNAs totais extraídos de plantas de Nicotiana benthamiana infectadas.

MATERIAL E MÉTODOS

Plantas de Nicotiana benthamiana foram inoculadas mecanicamente (COSTA & FORSTER, 1938) com as seguintes espécies de tospovírus: TSWV, TCSV, GRSV, INSV, CSNV, ZLCV e IYSV. Dez dias após a inoculação, folhas apresentando sintomas de mosaico foram armazenadas a - 80 ^oC para posterior extração de RNAs totais. As espécies de tospovírus foram identificadas através do seqüenciamento do gene N (DE ÁVILA et al., 1993a; BEZERRA et al., 1999; POZZER et al., 1999).

Utilizou-se o método descrito por CHOMCZYNSK & SACCHI (1987) para a extração de RNAs totais, em que 1 g de folhas de N. benthamiana foram maceradas em nitrogênio líquido, colocadas em contato com 10 mL de isotiocianato de guanidina 4M e transferidas para tubo de centrífuga. Após agitação vigorosa por 1 min, adicionou-se à mistura 1 mL de acetato de sódio 2M pH 4,0, seguida de nova agitação por 1 min e adição de 10 mL de fenol. Depois de mais uma agitação vigorosa, acrescentou-se à mistura 2 mL de clorofórmio mais álcool isoamílico (29:1). A mistura foi então centrifugada a 15.000 g por 40 min, a fase aquosa foi coletada e transferida para novo tubo, sendo adicionado igual volume de isopropanol. Em seguida, a mistura foi agitada por inversão e deixada em repouso por 12 h a -20 ^oC. A seguir, promoveu-se centrifugação por 30 min a 15.000 g, sendo o sedimento ressuspendido em 1 mL de água previamente tratada com 0,1 % de dietil pirocarbonato de sódio (DEPC).

Para a RT-PCR foram utilizados 2 pares de oligonucleotídeos. O primeiro par de oligonucleotídeos, denominados BR60 e BR65, foi desenhado para anelar em regiões conservadas do gene N (RNA S). O oligonucleotídeo BR60 (5' CCCGGATCCTGCAGAGCAATTGTGTCA 3') é complementar à região não traduzida da porção 3’ terminal do S RNA (nucleotídeos 1 a 15), e o BR65 (5' ATCAAGCCTTCTGAAAGTCAT 3') é idêntico à região correspondente a 200 nucleotídeos após o códon de iniciação (AUG) da proteína N (nucleotídeos 433 a 453). Os fragmentos resultantes da PCR por esses dois oligonucleotídeos apresentam 453 pares de bases (pb).

Para o RNA L foram desenhados dois oligonucleotídeos denominados PDH001 (vc) (5' CCCGGATCCTCGAGAGCAATCAGGTAACA 3'), complementar à região 3’terminal (nucleotídeos 1 a 17), e L1 (5' AATATAACTATAGAAACGAAA 3') idêntico à região correspondente a 731 nucleotídeos antes o terminal 3’ do RNA L (nucleotídeos 711 a 731). Os produtos da amplificação com esses dois oligonucleotídeos apresentam 731 pb. A posição dos oligonucleotídeos e os fragmentos de DNA amplificados via RT-PCR estão esquematizados na Figura 1.

Para a síntese das fitas de DNA complementar (cDNA), foram utilizados 3 µL (aproximadamente 1mg) de RNA total extraído, 1 µL (10 ng/µL) dos oligonucleotídeos BR60 (para o gene N) ou PDH001 (para o gene L) e 6 µL de água estéril. Após aquecimento a 90 ^oC por 2 min, seguido de choque térmico em gelo por 2 min, foram adicionados 4 µL de tampão da enzima transcriptase reversa (Gibco BRL), 0,3 µL (1U) da enzima transcriptase reversa (AMV, Gibco BRL), 0,2 µL de inibidor de RNAse (RNAsin), 0,2 µL da mistura de dNTPs (25mM) e 10 µL de água estéril. As amostras foram mantidas a 37 ^oC por 1h.

A reação em cadeia da polimerase (PCR) foi realizada segundo EIRAS (1997), onde para um volume final de 50 µL de cada amostra, acrescentaram-se 4 µL de tampão da enzima Taq DNA polimerase (CENBIOT/RS), 0,2 µL da mistura de dNTPs (25mM), 0,3 µL (2,5U) da enzima Taq DNA polimerase (CENBIOT/RS), 1 µL (10 ng/µL) de cada oligonucleotídeo, 33 µL de água estéril e 10 µL do cDNA. As amostras foram submetidas à reação de PCR em termo ciclador Gene Amp PCR System 2400 (Perkin Elmer), sendo aquecidas a 94 ^oC por 5 min e posteriormente submetidas a 30 ciclos de 1,5 min para desnaturação a 94 ^oC, 2 min para anelamento a 48 ^oC e 1 min para extensão a 72 ^oC. Ao término dos 30 ciclos, a temperatura foi mantida a 72 ^oC por 7 min para o término da extensão pela Taq DNA polimerase e finalmente mantida a temperatura de 4 ^oC. Os produtos amplificados foram observados em gel de agarose 1% corado com brometo de etídeo sob luz ultra-violeta (SAMBROOK et al., 1989).

Os produtos da RT-PCR obtidos (453 pb para o gene N, e 731 pb para o gene L) foram eluídos do gel utilizando-se o Sephaglass Bandprep kit (Pharmacia Biotech) e utilizados diretamente para a confecção das sondas radioativas. Para isso, foi utilizado o DNA labelling kit (dCTP) Ready to Go (Pharmacia Biotech), conforme instruções do fabricante.

Os RNAs totais extraídos foram adicionados (1µg) em membranas de náilon (Hybond^TM-N+, Amersham) utilizando-se o aparelho Convertible Filtration Manifold System (Gibco BRL), durante 15 min. Após exposição a UV por 5 min para fixação dos RNAs, as membranas foram pré-hibridizadas em solução de pré-hibridização (SSC 4X + 0,1% SDS + 0,05% blotto + 40% formamida + 10µg/ml de DNA de esperma de salmão) por 3 h a 45 ^oC, a fim de se promover o bloqueio de todas as regiões onde não se depositaram os ácidos nucléicos. A seguir as membranas foram incubadas a 45 ^oC por 12 h em contato com a sonda radioativa, previamente desnaturada a 95 ^oC por 3 min. Após a hibridização, a membrana foi lavada em SSC 2X a 45 ^oC por 20 min e em seguida em SSC 1X + SDS 0,1% a 45 ^oC por 20 min. Finalmente, a membrana foi colocada em contato com um filme de raio-X (KODAK) e revelada após 72 h de exposição (OWENS & DIENER, 1981; SAMBROOK et al., 1989; HUGUENOT et al., 1990).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

As técnicas de hibridização com sondas moleculares radioativas têm sido amplamente utilizadas para a detecção de patógenos em plantas, devido à sua sensibilidade e especificidade. Essas técnicas apresentam sensibilidade pelo menos 10 vezes superior à ELISA (EIRAS, 1999), mas exigem cuidados especiais para a manipulação de elementos radioativos. Apesar disso, as sondas radioativas têm sido empregadas com sucesso para detecção de diversos vírus e viróides em plantas (OWENS & DIENER, 1981; WETZEL et al., 1990; SEQUEIRA, 1992) e também para detecção de vírus nos insetos vetores (RICE et al., 1990).

Inicialmente, os métodos utilizados para detecção de tospovírus baseavam-se em inoculação mecânica em plantas indicadoras (BEST & GALLUS, 1953). Entretanto, após inoculações sucessivas pode haver atenuação dos sintomas devido à formação de mutantes defectivos interferentes (DI) (RESENDE et al., 1991a). ELISA também tem sido empregada para detecção de tospovírus (WANG & GONSALVES, 1990; RESENDE et al., 1991), e apesar da elevada sensibilidade e baixo custo, não apresenta um caráter universal, sendo vírusespecífica. A mistura de antissoros para a detecção universal de tospovírus através de ELISA também não é adequada devido a necessidade de se misturar pelo menos seis diferentes antissoros, o que resulta em diluição dos antissoros com possibilidade de escapes. Recentemente, a técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR), tem sido empregada para detecção de espécies de tospovírus, apresentando um caráter universal (MUMFORD et al., 1996; EIRAS et al., 1998). Esta técnica, apesar da elevada sensibilidade, especificidade e rapidez, pode apresentar resultados falsos negativos, podendo, dessa forma, haver o escape à detecção, além do elevado custo (EIRAS, 1997).

Na literatura há trabalhos de detecção de tospovírus utilizando sondas radioativas específicas para o gene do nucleocapsídeo (N), que não apresentam caráter universal, sendo vírus específicas (GERMAN & RICE, 1988; RONCO et al., 1989; RICE et al., 1990; DE HAAN et al., 1991; CHO et al., 1989). Estes fatos foram confirmados com os resultados obtidos para o gene N (fragmento de 453 pb), os quais foram positivos somente para a espécie TSWV, homóloga à sonda utilizada (Fig. 2A). Estes resultados também confirmam os resultados de ELISA, pois a divergência da proteína do nucleocapsídeo (codificada pelo gene N) é utilizada como parâmetro taxonômico (DE ÁVILA et al., 1993, 1993a).

A sonda L (fragmento de 731 pb) permitiu a detecção universal, sendo possível a hibridização com todas as espécies de tospovírus testadas (Fig. 2B). Estes resultados confirmam os dados relatados por VAN POLWIJK et al. (1997), que através do alinhamento das seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos do RNA L do INSV e do TSWV encontraram níveis elevados de identidade e similaridade, indicando que a polimerase viral deve ser bastante conservada entre as espécies de tospovírus.

O presente trabalho relata pela primeira vez a utilização de sondas radioativas como método para detecção simultânea de tospovírus. Com os resultados obtidos, têm-se à disposição novas possibilidades de diagnóstico molecular, que pode ser aplicado para detecção de tospovírus em programas de quarentena e para indexação de material vegetal proveniente de cultura in vitro. Além disso, hibridização com sondas não radioativas também podem ser utilizadas apresentando vantagens com relação à possibilidade de serem armazenadas por tempo indeterminado e por apresentarem menor risco para manipulação (EIRAS, 1997). Com o aumento da diversidade de tospovírus (DE ÁVILA et al., 1998; BEZERRA et al., 1999; POZZER et al., 1999), os métodos de detecção universal serão importantes principalmente para se evitar a introdução de uma nova espécie de tospovírus em uma nova região ou país, como recentemente ocorreu com a grande dispersão do INSV no hemisfério norte (MARCHOUX et al., 1991) e com a introdução acidental do CSNV na Holanda (VERHOEVEN & ROENHORST, 1998).

Fig. 1
Representação esquemática indicando as regiões de anelamento dos oligonucleotídeos nos RNAs genômicos de Tospovirus e os respectivos fragmentos de DNA, amplificados via RT-PCR, utilizados como sondas para hibridização.

Fig. 2
Hibridização via “slot-blot” com sonda radioativa específica para o gene N (fragmento de 453 pares de bases) (A), e para o gene L (fragmento de 731 pares de bases) (B), sintetizadas a partir da espécie Tomato spotted wilt virus (TSWV). Amostras constituem 1µg (30 µL) de RNAs totais extraídos para as seguintes espécies de tospovírus: TSWV, Tomato chlorotic spot virus (TCSV), Groundnut ringspot virus (GRSV), Impatiens necrotic spot virus (INSV), Chrysanthemum stem necrosis virus (CSNV), Zucchini lethal chlorosis virus (ZLCV) e Iris yellow spot virus (IYSV). Temperatura de hibridização de 45 ^oC.

Fig. 3
Hibridização via “slot-blot” com sonda radioativa do gene L (fragmento de 731 pares de bases), sintetizadas a partir da espécie Tomato spotted wilt virus (TSWV). Amostras constituem 1µg (30µL) de RNAs totais extraídos para as seguintes espécies de tospovírus: TSWV, Tomato chlorotic spot virus (TCSV), Groundnut ringspot virus (GRSV), Impatiens necrotic spot virus (INSV), Chrysanthemum stem necrosis virus (CSNV), Zucchini lethal chlorosis virus (ZLCV) e Iris yellow spot virus (IYSV). Temperatura de hibridização de 45 ^oC.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  20 Set 2024
• Data do Fascículo
  Jan-Jun 2001

Histórico

• Recebido
  18 Jul 2000