Acción antimicrobiana del gas ozono en superfi cies y en la microbiota del aire

ape Acta Paulista de Enfermagem Acta Paul Enferm. 0103-2100 1982-0194 Escola Paulista de Enfermagem, Universidade Federal de São Paulo Resumen Objetivo: Evaluar la acción antimicrobiana del gas ozono (O3) en superficies y en el aire interior climatizado artificialmente. Métodos: Estudio experimental/de laboratorio y transversal realizado en diez salas de un laboratorio de investigación en microbiología médica, con riesgo de seguridad biológica clase 2. Se evaluaron las superficies delimitadas en el piso, pared y mesa en cuanto a la presencia o ausencia de microorganismos, a partir de muestras recolectadas con hisopo humedecido en agua destilada estéril, antes y después de la exposición del gas O3 generado por dos máquinas distintas. Luego de este procedimiento, el hisopo fue inoculado en la superficie del medio de cultivo Brain Heart Infusion Agar DIFCO® (BHI), y después incubado a 35 °C por 24 horas. Para el análisis microbiológico del aire, se expuso una placa con BHI abierta durante una hora, antes y después del tratamiento del gas O3, y luego se incubó con los mismos criterios. Resultados: Se constató la actividad antimicrobiana del gas O3 generado por ambas máquinas en todas las áreas investigadas, y se registró una reducción del número de unidades formadoras de colonias. El potencial de inhibición antimicrobiana de los dispositivos se mantuvo próximo a los criterios de análisis adoptados, con énfasis en el área del piso y mesa. Considerando todas las salas y porcentajes de inhibición microbiana, con las dos máquinas, los resultados fueron: piso (100 %), mesa (90 %), pared (50 %) y aire (70 %). Conclusión: Las máquinas generadoras de gas O3 presentaron potencial antimicrobiano como medida de control de microorganismos presentes en superficies y aire interior climatizado artificialmente, lo que lo convierte en un desinfectante factible para ser usado. Introdução O controle de Infecções Relacionadas à Assistência à Saúde (IRAS) representa um assunto sensível para a saúde pública, por ser motivo de morbidade, mortalidade e custos elevados, sobretudo em países em desenvolvimento.(1–3) O ambiente participa efetivamente na transmissão de micro-organismos, onde a contaminação de superfícies inanimadas é o potencial reservatório. Os equipamentos e as superfícies de áreas hospitalares exercem um papel na disseminação de IRAS, muitas vezes, como reservatórios secundários, sendo capaz de promover contaminação cruzada.(4) Neste cenário, não menos importante, o uso de condicionadores de ar como prática de climatização ambiental artificial mantém o ar reciclado com partículas microbianas e aerossóis, que comprometem a qualidade do mesmo, constituindo-se como fator de risco para a doença infecciosa.(5) As práticas de limpeza e desinfecção (L/D) de ambientes, superfícies e equipamentos fazem parte dos programas de controle de infecção, na tentativa de adequar o ambiente, minimizando o risco de doenças.(4,6,7) Neste cenário, o uso de desinfetantes é uma prática padrão para o controle microbiano, incluindo a vaporização com formaldeído, ácido peracético ou clorexidina, hipoclorito de sódio e formulações isoladas ou combinadas com peróxido de hidrogênio.(8) Tais métodos têm desvantagens, como o alto custo, a prática laboral de preparo, além do potencial para inalação dos vapores tóxicos pelos profissionais que atuam próximos aos produtos.(9,10) Nessa perspectiva, o ozônio é apresentado na forma triatômica do oxigênio (O3) e vem sendo utilizado como elemento químico de controle de microrganismos em diversos segmentos da área da saúde, destacando-se no tratamento aos resíduos hospitalares,(11) pré-tratamento da cavidade dentária,(12) desinfecção de máquinas de hemodiálise,(13) desinfecção de salas cirúrgicas,(14) entre outros. Na área de alimentos, o processo de sanitização vem sendo estruturado por equipamentos geradores de ozônio, resultando em ambiente adequado para os processos de maturação de queijos.(15–17) Considerando a ação antimicrobiana, o O3 atua na oxidação de glicopeptídeos, glicoproteínas e aminoácidos da parede celular, modificando a permeabilidade e ocasionando a lise celular. Ao penetrar no interior da célula, o O3 recombina-se com elementos citoplasmáticos acarretando a oxidação de aminoácidos e ácidos nucléicos, consequentemente a clivagem e morte celular. Além disso, o O3 promove o colapso da atividade enzimática celular, atacando os grupos sulfidrila de enzimas, bem como modificando as bases púricas e pirimídicas dos ácidos nucleicos.(18–20) Apesar de já ser utilizado em ambiente hospitalar há algum tempo, pouco se sabe sobre o potencial desse agente, principalmente em um contexto brasileiro de assistência, tendo em vista a escassez de estudo sobre o tema. Nessa perspectiva, esta pesquisa objetivou avaliar a ação antimicrobiano do gás O3 em superfícies e ar ambiente climatizado artificialmente. Métodos Tipo de estudo Trata-se de uma pesquisa experimental/laboratorial e transversal realizada em dez salas internas de um laboratório de pesquisa em microbiologia clínica, que realiza exames bacteriológicos e micológicos como parte de projetos de pesquisas. Esse ambiente segue os critérios de biossegurança - Nível de Biossegurança 2 (NB2), apresentando condições físico-químicas estáveis (umidade, temperatura e limpeza e desinfecção padrão). No entanto, se caracteriza como uma área crítica, com possibilidade de contaminação microbiana. As salas apresentam dados comuns quanto à área física, iluminação, temperatura, umidade e circulação de pessoas, portanto estão sujeitas às mesmas condições de risco microbiano. Fazem parte das bancadas: estufas, luminárias, banho maria, computadores e armários de madeira. Protocolo do estudo Dez salas de ambiente controlado, com área de 9 m2 foram submetidas à análise microbiológica antes e após uma hora de exposição do gás O3, gerado por dois equipamentos: geradores de O3 - GEO 20000/AR-TD (Mod.I) e GEO 20000/AR (Mod.II), produzidos pela empresa OZON® (Quadro 1). A produção do O3 ocorre por descarga eletroquímica, onde o equipamento é composto por dois eletrodos (alta e baixa tensão) que são submetidos a diferentes potenciais de ação, e a passagem de ar (O2) entre os dois eletrodos produz mudança eletrostática, com geração de O3. Ressalta-se que o ambiente em que está sendo gerado o O3 esteja livre de pessoas. Os experimentos conduzidos pelos dois equipamentos I e II ocorreram em um intervalo de 6 meses. Quadro 1 Modelos GEO 20000/AR-TD (Mod.I) e GEO 20000/AR (Mod.II) Especificações técnicas GEO 20000–AR/TD (Mod.I) GEO 20000/AR (Mod.II) Vazão (m3/h)/ppm ozônio 200/2,0 ppm 100/2,1 ppm Umidade relativa máxima (%) 75 75 Temperatura de trabalho (°C) 6 – 35 5 – 40 Potência nominal (W) 135 127 Tensão de alimentação (V) 127 110 Peso (kg) 5,40 4,9 Área máxima de trabalho (m2) 300 300 Dimensões (cm) 18x30x47,5 18x30x37 M3/H – Metro cúbico por hora; % - Porcentagem; °C – Grau Celsius; W – Watt; V – Volt; KG – Kilograma; M2 – Metro quadrado; CM – Centímetro; PPM – Partes por milhão Para a investigação microbiológica das superfícies da parede, chão e bancada, a coleta foi conduzida por um swab pré-umedecido em água destilada estéril, sendo posto em contato sobre a área específica de um quadrante de 30X30 cm2. Seguiu-se com a inoculação imediata do mesmo na superfície de meio de cultura contendo BHI e incubação a 35ºC por 24 horas. Na etapa subsequente do experimento, o equipamento gerador de O3, localizado no chão da parte central das salas, foi ligado por uma hora, e a área de investigação mantida fechada e lacradas durante todo o procedimento de sanitização, sem qualquer interferência. Ao término deste período, novas coletas foram realizadas, utilizando-se um outro swab, agora, submetido ao contato da superfície diametralmente oposta do quadrante, seguindo-se os procedimentos de análise como da primeira etapa. A figura 1 ilustra as áreas investigadas, bem como a disposição do aparelho gerador de O3. Figura 1 Figura ilustrativa da disposição do ozonizador e pontos coletados As amostras de ar ambiente foram coletadas por meio da técnica de sedimentação simples, antes e após uma hora de exposição do gás O3, e constituiu um parâmetro de investigação, com exposição de placas de Petri, contendo BHI, mantidas abertas por uma hora e incubação das mesmas a 35°C, por 24 horas (Figura 2). Registros de temperatura e umidade das salas foram monitorados. Figura 2 Figura ilustrativa da disposição da placa de Petri para análise do ar A ação antimicrobiana foi elaborada por contagem das Unidades Formadoras de Colônias (UFC) na superfície da placa de Petri, do inóculo oriundo das superfícies de chão, bancada, parede e ar do ambiente, antes e após o tratamento com O3. A recomendação clássica e consensual dos métodos seguros para desinfecção das superfícies consiste na limpeza prévia do local, seguida de desinfecção com um agente microbicida.(21) No atual estudo, as superfícies foram analisadas sem nenhum processo de limpeza prévia, pois os objetivos previam a análise da redução microbiana original. Análise dos dados Os dados coletados foram consolidados no software SPSS (20.0), submetidos á análise estatística, por meio do teste t de student pareado para comparar as duas amostras, (antes e depois) e verificar se existe diferença significativa de uma variável entre os dois grupos de interesse. O teste de Wilcoxon foi utilizado para verificar de modo geral a eficiência dos aparelhos ozonizadores, que consiste em um método não-paramétrico para comparação de duas amostras. Resultados A atividade antimicrobiana do gás ozônio foi efetiva para todas as áreas estudadas, com registros de redução do número de UFC, frente aos dois equipamentos (Tabelas 1 e 2). Tabela 1 Apresentação numérica da UFC e percentual obtidos antes (A) e após (D) a exposição do ozônio (APARELHO I) em dez salas Local Sala 1 Sala 2 Sala 3 Sala 4 Sala 5 Sala 6 Sala 7 Sala 8 Sala 9 Sala 10 Chão A (UFC) 1 7 2 19 9 17 110 10 11 30 D (UFC) 0 5 1 4 6 10 105 7 5 25 % 100 29 50 79 33 41 5 30 55 17 Bancada A (UFC) 10 7 10 2 32 30 18 3 12 44 D (UFC) 7 5 5 2 31 21 2 2 6 10 % 30 29 50 0 3 30 89 33 50 77 Parede A (UFC) 1 0 1 1 1 14 0 3 2 1 D (UFC) 0 0 1 1 1 8 0 0 0 0 % 100 0 0 0 0 43 0 100 100 100 Ar A (UFC) 0 1 1 3 1 11 0 2 0 6 D (UFC) 0 0 0 1 0 6 0 0 0 3 % 0 100 100 67 100 45 0 100 0 50 A – Antes; D – Após; % - Percentagem de redução microbiana Tabela 2 Apresentação numérica da UFC e percentual obtidos antes (A) e após (D) a exposição do ozônio (APARELHO II) em dez salas Local Sala 1 Sala 2 Sala 3 Sala 4 Sala 5 Sala 6 Sala 7 Sala 8 Sala 9 Sala 10 Chão A (UFC) 89 479 309 94 193 182 782 186 55 114 D (UFC) 22 39 68 74 162 69 167 131 53 74 % 75 92 78 22 16 62 79 30 4 35 Bancada A (UFC) 23 36 0 281 5 15 9 73 26 54 D (UFC) 16 19 0 55 4 2 5 4 7 41 % 30 47 0 80 20 87 45 95 73 24 Parede A (UFC) 3 0 0 1 0 4 1 3 1 1 D (UFC) 0 0 0 1 0 3 0 1 1 0 % 100 0 0 0 0 25 100 67 0 100 Ar A (UFC) 0 1 1 0 1 4 0 0 2 1 D (UFC) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 % 0 100 100 0 100 100 0 0 100 100 A – Antes; D – Após; % - Percentagem de redução microbiana Considerando-se a atividade do ozônio gerado pelo equipamento I, no chão de todas as salas, houve redução da carga microbiana (UFC) e negativação da contagem para sala 1. Este evento também foi observado para as bancadas, com a exceção da sala 4, que manteve a mesma contagem de colônias, antes e após a aplicação do ozônio. Considerando-se as paredes, 50% apresentaram redução da contaminação microbiana. Considerando o ar ambiental como objeto de análise, notou-se uma redução da contaminação em sete salas, sendo que nas demais não foram detectados microrganismos nem antes (A) e após (D) a exposição do O3. Os resultados obtidos da atividade antimicrobiana do gás ozônio, frente ao equipamento II estão apresentados na tabela 2. Novamente, ficou evidente a atividade antimicrobiana, uma vez que houve redução da UFC para todas as variáveis estudadas, como ar e superfícies, antes e após a exposição do gás O3. Foi observada apenas em duas salas (4 e 9) a manutenção do número de UFC para os dois tempos de investigação. Independentemente dos equipamentos, o controle microbiano foi maior para as áreas de chão e bancada. Além disso, considerando todas as áreas investigadas, o Mod.I e o Mod.II apresentaram diferenças estatísticas significativas (p<0,05). Quando avaliados separadamente, em relação a cada uma das superfícies e o ar ambiental, os resultados não foram significantes, com exceção da parede (p=0,0639) e bancada (p=0,1267), respectivamente. Ressalta-se que os equipamentos I e II apresentam vazão de gás ozonizado e concentração distintos, isto é, de 200 e 100 m3/h - 2,0 e 2,1 ppm de gás ozônio, respectivamente. Os registros de temperatura e a umidade das salas mostraram valores médios de 21 ºC e 58% para os dois momentos de investigação. Discussão Esta pesquisa possui limitações associadas ao desenho de estudo (experimental-laboratorial e transversal). A condição ambiental das salas laboratoriais foi considerada como parâmetro de análise e inferência para o ambiente hospitalar. No entanto, isto não descaracteriza a importância da pesquisa como protótipo para a avaliação da ação microbiológica, em dois tempos de investigação, antes a após a exposição do ozônio. Neste sentido, os pesquisadores pretenderam mimetizar a realidade de ambientes, quanto à ocorrência de microrganismos presentes em superfícies e no ar, introduzir o processo de sanitização, para depois desenvolver protocolos de higienização ambiental. A aplicabilidade prática do gás O3 em ambiente hospitalar pode melhorar a condição microbiológica, prevenindo e podendo contribuir para a redução das taxas de IRAS. Além disso, a característica portátil do equipamento torna o processo de sanitização móvel e factível para monitoramento de áreas hospitalares específicas. Já é conhecido que o O3 faz parte da rotina de desinfecção e sanitização de outros ambientes,(22) com controles para bactérias e fungos.(15,17) No entanto, este estudo vem expandir o que já se sabe sobre o gás, uma vez que a negativação do crescimento microbiano, ou redução da contagem de UFC em placas após a exposição do gás O3 para qualquer superfície analisada, em comparação ao grupo controle, comprova a eficácia do composto químico nos processos de controle microbiano. Evento semelhante foi narrado na descontaminação de sala cirúrgica de um Hospital Veterinário.(14) Nos dois estudos, fica evidente o potencial do gás O3 no processo de desinfecção de ambiente, uma vez que a diminuição na contagem de aeróbios mesófilos, bolores e leveduras ocorreu com frequência. Considerando-se o processo de eliminação microbiana pelo gás O3, é conhecido que a destruição celular se dá por oxidação de elementos estruturais, sem especificidade a alvos presentes na célula bacteriana ou fúngica.(18) Neste sentido, organismos multirresistentes podem ser eliminados, com ampla vantagem, se comparados aos métodos de desinfecção mecânica com desinfetantes líquidos de superfícies ambientais em Estabelecimentos de Assistência à Saúde (EAS), incluindo o ambiente hospitalar, onde é comum a utilização de outros compostos químicos na forma líquida. São fundamentais nas pesquisas epidemiológicas, amostras biológicas que indicam o ambiente ou superfícies como prováveis reservatórios na transmissão de IRAS.(23,24) Nos hospitais, a limpeza terminal é feita abrangendo áreas e superfícies próximas ou em contato com o paciente, após a saída do mesmo, seja por óbito, transferência ou término de isolamento,(24–27) e, apesar dos esforços, nem sempre o resultado dos processos de L/D é satisfatório.(28,29) O uso do gás O3 na pesquisa traz comprovação científica sobre o potencial controle microbiano, desta forma, o O3 mostra-se um composto capaz de ser utilizado como procedimento de sanitização de ambientes constituintes da área da saúde. Nesta pesquisa, foram observadas diferenças entre dois equipamentos geradores de gás O3, em relação ao potencial antimicrobiano sobre as mesmas condições na sanitização de ambientes, com destaque à vazão e potência nominal dos aparelhos. Os resultados mostraram diferenças significativas para alguns parâmetros, porém, de modo geral, de um modelo para outro, o potencial sanitizante foi próximo. Protocolos inovadores poderão ser criados com o objetivo de melhorar o padrão antimicrobiano aqui detectado. Os valores de UFC de uma sala para outra apresentaram diferenças. Isso mostra que um ambiente nem sempre apresenta as mesmas condições microbiológicas, evento esperado, considerando-se o ambiente hospitalar. Com a delimitação de áreas investigadas, antes e após o tratamento com o gás O3, tem-se apenas uma amostragem de área da superfície, o que não garante que em toda extensão, os resultados seriam os mesmos. Mais uma vez, a prática de sanitização pelo ozônio, gerado por equipamento portátil, certamente viabiliza a implantação de novas medidas de controle microbiano no ambiente hospitalar. As superfícies do chão e bancadas apresentaram maior contagem no número de UFC, e, ao mesmo tempo, corresponderam às áreas de maior inibição microbiana pelo ozônio. As partículas microbianas são densas em relação ao ar, fato que normalmente contribui para a permanência de patógenos potenciais no chão de ambiente nosocomial.(30) Neste sentido, o equipamento portátil pode ser levado próximo às áreas de alta contaminação ambiental e reduzir a carga microbiana. Segundo a literatura, o efeito antimicrobiano do O3 depende de alguns fatores como o tempo de exposição, concentração, temperatura e umidade.(31) No entanto, no atual estudo, estes critérios foram avaliados e mantidos em igualdade de condições experimentais minimizando possíveis vieses. Nesse sentido, faz-se necessário outros estudos que considerem outros parâmetros de temperatura, da umidade relativa, concentração e o tempo de exposição. O O3, quando inalado em altas concentrações, pode ser tóxico, apresentando riscos à saúde respiratória.(32) Os dois equipamentos testados geram pequena quantidade de ozônio (2,0-2,1 ppm), e durante a sua utilização, não devem permanecer pessoas no ambiente. Deve-se considerar a pequena importância dada em relação à qualificação do grupo do Serviço de Limpeza e Desinfecção de Superfícies em Serviços de Saúde, o qual possui papel essencial na redução das IRAS. Desta forma, é fundamental que as práticas de L/D de ambientes, equipamentos e superfícies façam parte das Comissões de Controle de Infecção Hospitalar, junto com a enfermagem e serviços de limpeza, desenvolvendo atividades relacionadas a protocolos de higiene ambiental, supervisão e treinamento das equipes.(33,34) Outro ponto importante de se destacar na utilização de tecnologias que não utilizam a ação mecânica para realizarem a desinfecção de ambientes e superfícies é o fato que áreas adjacentes não são garantidas de serem desinfetadas, assim, não substituem a ação mecânica de L/D.(35) Por fim, ressalta-se que a busca por novos produtos ou métodos e práticas hospitalares para desinfecção de superfícies e redução da microbiota de ar artificialmente climatizado vem se intensificando ao longo do tempo, sendo o gás O3 um composto promissor. Ainda não há muitos estudos na literatura abordando esse objeto de pesquisa, e aqueles que o fazem apresentam condições experimentais bem variadas, o que sugere a necessidade de criação de protocolos bem elaborados, para fins de controle microbiano. Conclusão Nossos achados evidenciam o potencial antimicrobiano do gás O3 produzido pelos dois equipamentos e os critérios descritos obedecidos garantiram uma ação antimicrobiana. A ozonização do ambiente se constitui um procedimento prático de sanitização de superfícies e ar climatizado artificialmente. Depreende-se que essa tecnologia seja factível para utilização em diversos segmentos onde se busca a redução da densidade microbiana. Este recurso poderá compor os protocolos de sanitização de ambientes e superfícies hospitalares, valorizada a rapidez e facilidade de execução, garantindo o controle de desenvolvimento microbiano, condição fundamental para a manutenção da qualidade ambiental microbiologicamente segura. 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Disponível em: https://www20.anvisa.gov.br/segurancadopaciente/index.php/publicacoes/item/seguranca-do-paciente-em-servicos-de-saude-limpeza-e-desinfeccao-de-superficies 22 Coelho CC Freitas-Silva O Campos RS Bezerra VS Cabral LM Ozonation as post-harvest technology in conservation of fruits and vegetables: A review Rev Bras Eng Agríc Ambiental 2015 19 4 369 375 Portuguese 22. Coelho CC, Freitas-Silva O, Campos RS, Bezerra VS, Cabral LM. [Ozonation as post-harvest technology in conservation of fruits and vegetables: A review]. Rev Bras Eng Agríc Ambiental. 2015;19(4):369–75. Portuguese 23 Otter JA Yezli S French GL The role played by contaminated surfaces in the transmission of nosocomial pathogens Infect Control Hosp Epidemiol 2011 32 7 687 699 23. Otter JA, Yezli S, French GL. The role played by contaminated surfaces in the transmission of nosocomial pathogens. Infect Control Hosp Epidemiol. 2011;32(7):687–99. 24 Rutala WA Weber DJ Are room decontamination units needed to prevent transmission of environmental pathogens? Infect Control Hosp Epidemiol 2011 32 8 743 747 24. Rutala WA, Weber DJ. Are room decontamination units needed to prevent transmission of environmental pathogens? Infect Control Hosp Epidemiol. 2011;32(8):743–7. 25 Arroyo MG Ferreira AM Frota OP Rigotti MA de Andrade D Brizzotti NS Effectiveness of ATP bioluminescence assay for presumptive identification of microorganisms in hospital water sources BMC Infect Dis 2017 17 1 458 458 25. Arroyo MG, Ferreira AM, Frota OP, Rigotti MA, de Andrade D, Brizzotti NS, et al. Effectiveness of ATP bioluminescence assay for presumptive identification of microorganisms in hospital water sources. BMC Infect Dis. 2017;17(1):458. 26 Anderson DJ Moehring RW Weber DJ Lewis SS Chen LF Schwab JC CDC Prevention Epicenters Program. Effectiveness of targeted enhanced terminal room disinfection on hospital-wide acquisition and infection with multidrug-resistant organisms and Clostridium difficile: a secondary analysis of a multicentre cluster randomised controlled trial with crossover design (BETR Disinfection) Lancet Infect Dis 2018 08 18 8 845 853 26. Anderson DJ, Moehring RW, Weber DJ, Lewis SS, Chen LF, Schwab JC, et al.; CDC Prevention Epicenters Program. Effectiveness of targeted enhanced terminal room disinfection on hospital-wide acquisition and infection with multidrug-resistant organisms and Clostridium difficile: a secondary analysis of a multicentre cluster randomised controlled trial with crossover design (BETR Disinfection). Lancet Infect Dis. 2018 Aug;18(8):845–53. 27 Mitchell BG Hall L White N Barnett AG Halton K Paterson DL An environmental cleaning bundle and health-care-associated infections in hospitals (REACH): a multicentre, randomised trial Lancet Infect Dis 2019 19 4 410 418 27. Mitchell BG, Hall L, White N, Barnett AG, Halton K, Paterson DL, et al. An environmental cleaning bundle and health-care-associated infections in hospitals (REACH): a multicentre, randomised trial. Lancet Infect Dis. 2019;19(4):410–8. 28 Rutala WA Weber DJ Monitoring and improving the effectiveness of surface cleaning and disinfection Am J Infect Control 2016 44 5 Suppl e69 e76 28. Rutala WA, Weber DJ. Monitoring and improving the effectiveness of surface cleaning and disinfection. Am J Infect Control. 2016;44(5 Suppl):e69–76. 29 Doll M Stevens M Bearman G Environmental cleaning and disinfection of patient areas Int J Infect Dis 2018 67 52 57 29. Doll M, Stevens M, Bearman G. Environmental cleaning and disinfection of patient areas. Int J Infect Dis. 2018;67:52–7. 30 Salimifard P Rim D Gomes C Kremer P Freihaut JD Resuspension of biological particles from indoor surfaces: effects of humidity and air swirl Sci Total Environ 2017 583 241 247 30. Salimifard P, Rim D, Gomes C, Kremer P, Freihaut JD. Resuspension of biological particles from indoor surfaces: effects of humidity and air swirl. Sci Total Environ. 2017;583:241–7. 31 Kim JG Yousef AE Dave S Application of ozone for enhancing the microbiological safety and quality of foods: a review J Food Prot 1999 62 9 1071 1087 31. Kim JG, Yousef AE, Dave S. Application of ozone for enhancing the microbiological safety and quality of foods: a review. J Food Prot. 1999;62(9):1071–87. 32 Nuvolone D Petri D Voller F The effects of ozone on human health Environ Sci Pollut Res Int 2018 25 9 8074 8088 32. Nuvolone D, Petri D, Voller F. The effects of ozone on human health. Environ Sci Pollut Res Int. 2018;25(9):8074–88. 33 Furlan MC Ferreira AM Rigotti MA Guerra OG Frota OP Sousa AF Correlation among monitoring methods of surface cleaning and disinfection in outpatient facilities Acta Paul Enferm 2019 32 3 282 289 33. Furlan MC, Ferreira AM, Rigotti MA, Guerra OG, Frota OP, Sousa AF, et al. Correlation among monitoring methods of surface cleaning and disinfection in outpatient facilities. Acta Paul Enferm. 2019;32(3):282–9. 34 Paina T Rodrigues JN Felippe JC Nogueira PC Paiva SM Conhecimento de auxiliares de higienização sobre limpeza e desinfecção relacionados à infecção hospitalar Rev Enferm UFSM 2015 5 1 121 130 34. Paina T, Rodrigues JN, Felippe JC, Nogueira PC, Paiva SM. Conhecimento de auxiliares de higienização sobre limpeza e desinfecção relacionados à infecção hospitalar. Rev Enferm UFSM. 2015;5(1):121–30. 35 Weber DJ Kanamori H Rutala WA ‘No touch’ technologies for environmental decontamination: focus on ultraviolet devices and hydrogen peroxide systems Curr Opin Infect Dis 2016 29 4 424 431 35. Weber DJ, Kanamori H, Rutala WA. ‘No touch’ technologies for environmental decontamination: focus on ultraviolet devices and hydrogen peroxide systems. Curr Opin Infect Dis. 2016;29(4):424–31. Original Article Antimicrobial action of ozone gas on surfaces and in the air 0000-0002-5540-4550 Caetano Maicon Henrique 1 0000-0002-5807-9204 Siqueira João Paulo Zen 2 0000-0002-3336-2695 Andrade Denise de 3 0000-0003-2710-2122 Sousa Álvaro Francisco Lopes de 3 4 0000-0002-9234-6257 Rigotti Marcelo Alessandro 5 0000-0002-8823-5626 Diniz Maiara Oliveira 6 0000-0001-7074-1988 Almeida Willian Albuquerque de 6 0000-0002-4054-768X Ferreira Adriano Menis 5 0000-0002-8665-9126 Almeida Margarete Teresa Gottardo de 2 1 São José do Rio Preto SP Brazil Universidade Estadual Paulista, São José do Rio Preto, SP, Brazil. 2 São José do Rio Preto SP Brazil Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto, São José do Rio Preto, SP, Brazil. 3 Ribeirão Preto SP Brazil Escola de Enfermagem de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brazil. 4 Lisbon Portugal Instituto de Higiene e Medicina Tropical, Universidade NOVA de Lisboa, Lisbon, Portugal. 5 Três Lagoas MS Brazil Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, Três Lagoas, MS, Brazil. 6 Campo Grande MS Brazil Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, Campo Grande, MS, Brazil. Corresponding author Margarete Teresa Gottardo de Almeida Email: [e-mail] Conflicts of interest: none. Collaborations Caetano MH, Siqueira JPZ, Andrade D, Sousa AFL, Rigotti MA, Diniz MO, Almeida WA, Ferreira AM, Almeida MTG contributed to the study design, data analysis and interpretation, writing of the article and critical review of the intellectual content. All the authors approved the final version for publication. Abstract Objective: Assess the antimicrobial action of ozone gas (O3) on surfaces and artificially cooled ambient air. Methods: Cross-sectional experimental/laboratory study carried out in ten rooms of a medical microbiology research lab, with class 2 biosafety risk. The demarcated surfaces on the floor, wall and counter were assessed in relation to the presence or absence of microorganisms, based on collections done with swabs dampened in sterile distilled water, before and after exposure to ozone gas produced by two different generators. After this procedure, each swab was inoculated on the surface of a Brain Heart Infusion Agar DIFCO® (BHI) culture, followed by incubation at 35ºC for 24 hours. For the microbiological analysis of the air, a petri dish with BHI was openly exposed for one hour, before and after treatment with O3 gas, and were incubated according to the same criteria. Results: The antimicrobial activity of the O3 gas produced by both generators was checked in all the areas investigated, with records indicating a decrease in the number of colony-forming units. The antimicrobial inhibition potential of the generators was close to the analysis criteria adopted, particularly for the floor and counter areas. Based on all the rooms and microbial inhibition percentages, in relation to the two generators, the results were: floor (100%), counter (90%), wall (50%) and air (70%). Conclusion: The O3 generators had antimicrobial potential as a procedure for controlling microorganisms present on surfaces and in artificially cooled ambient air, constituting a feasible sanitizer. Keywords Anti-infective agents Ozone Ozonation Disinfection Products with antimicrobial action Air pollution indoor Introduction The control of healthcare-associated infections (HAI) is a sensitive public health issue, since it results in morbidity, mortality and high costs, particularly in developing countries.(1–3) Environments participate in the transmission of microorganisms, with contamination of inanimate surfaces acting as potential reservoirs. Equipment and surfaces in hospital areas play a role in disseminating HAI, often as secondary reservoirs, and can promote cross-contamination.(4) Likewise important in this context, the use of air conditioners as an artificial ambient cooling practice recycles air with microbial and aerosol particles, which impair air quality and are a risk factor for infectious disease.(5) Cleaning and disinfection practices for environments, surfaces and equipment are part of infection control programs, in an effort to prepare environments and minimize disease risk.(4,6,7) In this regard, the use of disinfectants is a standard practice for microbial control, including vaporization with formaldehyde, peracetic acid or chlorhexidine, sodium hypochlorite and formulations isolated or combined with hydrogen peroxide.(8) There are disadvantages with these methods, such as high costs and preparation of labor, as well as the possibility that employees working close to the products will inhale toxic vapors.(9,10) In this context, ozone is presented in the triatomic form of oxygen (O3) and has been used as a chemical element to control microorganisms in various segments of the health sector, particularly in hospital waste treatment,(11) pretreatment of dental cavities,(12) disinfection of hemodialysis machines(13) and disinfection of operating rooms,(14) among others. In the food sector, the sanitization process has been structured by ozone generators, resulting in adequate environments for cheese ripening processes.(15–17) In terms of antimicrobial action, O3 acts in the oxidation of glycopeptides, glycoproteins and amino acids of the cell wall, modifying permeability and causing cell lysis. When it penetrates the interior of the cell, O3 recombines with cytoplasmic elements leading to the oxidation of amino acids and nucleic acids and, consequently, to cleavage and cell death. O3 also promotes the collapse of cellular enzymatic activity, attacking the sulfhydryl enzyme groups, as well as modifying the purine and pyrimidine bases of nucleic acids.(18–20) Although it has been used in hospital environments for some time, little is known about the potential of this agent, particularly in the Brazilian care context, as seen by the scarcity of studies on the topic. Therefore, this study sought to assess the antimicrobial action of ozone gas on surfaces and artificially cooled ambient air. Methods Type of study This was a cross-sectional experimental/laboratory study carried out in ten internal rooms of a clinical microbiological research laboratory, which performs bacteriological and mycological tests as a part of its research projects. This environment adheres to biosafety criteria - Biosafety Level 2 (BN2), and has stable physical-chemical conditions (humidity, temperature and standard cleaning and disinfection). However, it is characterized as a critical area, with the possibility of microbial contamination. The rooms had common data in terms of physical space, lighting, temperature, humidity and circulation of people and were, therefore, subject to the same microbial risk conditions. The counters contained: ovens, lighting, water bathes, computers and wood cupboards. Study protocol Ten climate-controlled rooms, with an area of 9 m2, underwent a microbiological analysis before and after exposure to O3 gas, generated by two O3 generators - GEO 20000/AR-TD (Mod. I) and GEO 20000/AR (Mod. II), manufactured by the company OZON® (Chart 1). The O3 was produced through electrochemical discharge; the equipment was composed of two electrodes (high and low voltage) which are subjected to different action potentials, and the passage of air (O2) between the two electrodes produces an electrostatic change, with generation of O3. It should be noted that the environment in which O3 was being generated was free of people. The experiments, conducted with the two generators I and II, occurred in six-month intervals. Chart 1 Models GEO 20000/AR-TD (Mod. I) and GEO 20000/ AR (Mod. II) Technical specifi cations GEO 20000–AR/TD (Mod. I) GEO 20000/AR (Mod. II) Ozone flow (m3/h)/ppm 200/2.0 ppm 100/2.1 ppm Maximum relative humidity (%) 75 75 Working temperature (°C) 6 – 35 5 – 40 Output power (W) 135 127 Supply voltage (V) 127 110 Weight (kg) 5.40 4.9 Maximum work area (m2) 300 300 Dimensions (cm) 18x30x47.5 18x30x37 M3/H – Cubic meter per hour; % – Percentage; °C Degree Celsius; W – Watt; V – Volt; kg – Kilogram; M2 – Square meter; CM – Centimeter; PPM – Parts per million For the microbiological investigation of the wall, floor and counter surfaces, the collection was done using a swab pre-moistened in sterile distilled water, which was placed in contact with a specific area of 30X30 cm2 quadrant. The swab was then immediately inoculated on the surface of a culture medium containing BHI and incubated at 35ºC for 24 hours. In the next stage of the experiment, the O3 generators located on the floor in the center of the rooms was turned on for an hour. The investigation site was kept shut and sealed throughout the sanitization procedure, without any interference. At the end of this period, a new collection was performed, using another swab, placed this time in contact with the surface diametrically opposite the quadrant, following the same analysis procedures as in the first stage. Figure 1 illustrates the investigated sites, as well as the arrangement of the ozone generator. Figure 1 Illustration of the arrangement of the ozone generator and collection points The ambient air samples were collected through a simple sedimentation technique, before and after exposure to O3 gas, and constituted an investigation parameter, with exposure of Petri dishes, containing BHI, kept open for one hour and incubated at 35°C for 24 hours (Figure 2). The temperature and humidity of the rooms were monitored. Figure 2 Illustration of the arrangement of the Petri dish for the air analysis. Antimicrobial action was determined by the number of colony-forming units (CFU) on the surface of the Petri dish, from inocula from the floor, counter and wall surfaces and ambient air, before and after treatment with O3. The classic and consensual recommendation of safe methods for disinfecting surfaces entails prior cleaning of the site, followed by disinfection with a microbicide agent.(21) In the present study, the surfaces were analyzed without any prior cleaning process, since the objective was to determine microbial reduction. Data analysis The collected data was consolidated in SPSS (20.0) software and underwent a statistical analysis, using the paired student’s t-test, to compare two samples (before and after) and determine whether there was a significant difference in a variable between the two groups of interest. The Wilcoxon test, a nonparametric method for comparing two samples, was used to verify the overall efficiency of the ozone generators. Results The antimicrobial action of the ozone gas was effective for all the areas studied, there was a reduction in the CFU count, in relation to the two generators (Tables 1 and 2). Table 1 Numerical presentation of CFU and percentages obtained before (B) and after (A) exposure to ozone (Generator I) in ten rooms Location Room 1 Room 2 Room 3 Room 4 Room 5 Room 6 Room 7 Room 8 Room 9 Room 10 Floor B (CFU) 1 7 2 19 9 17 110 10 11 30 A (CFU) 0 5 1 4 6 10 105 7 5 25 % 100 29 50 79 33 41 5 30 55 17 Counter B (CFU) 10 7 10 2 32 30 18 3 12 44 A (CFU) 7 5 5 2 31 21 2 2 6 10 % 30 29 50 0 3 30 89 33 50 77 Wall B (CFU) 1 0 1 1 1 14 0 3 2 1 A (CFU) 0 0 1 1 1 8 0 0 0 0 % 100 0 0 0 0 43 0 100 100 100 Air B (CFU) 0 1 1 3 1 11 0 2 0 6 A (CFU) 0 0 0 1 0 6 0 0 0 3 % 0 100 100 67 100 45 0 100 0 50 B - Before; A - After; % - Percentage of microbial reduction Table 2 Numerical presentation of CFU and percentages obtained before (B) and after (A) exposure to ozone (Generator II) in ten rooms Location Room 1 Room 2 Room 3 Room 4 Room 5 Room 6 Room 7 Room 8 Room 9 Room 10 Floor A (CFU) 89 479 309 94 193 182 782 186 55 114 D (CFU) 22 39 68 74 162 69 167 131 53 74 % 75 92 78 22 16 62 79 30 4 35 Counter A (CFU) 23 36 0 281 5 15 9 73 26 54 D (CFU) 16 19 0 55 4 2 5 4 7 41 % 30 47 0 80 20 87 45 95 73 24 Wall A (CFU) 3 0 0 1 0 4 1 3 1 1 D (CFU) 0 0 0 1 0 3 0 1 1 0 % 100 0 0 0 0 25 100 67 0 100 Air A (CFU) 0 1 1 0 1 4 0 0 2 1 D (CFU) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 % 0 100 100 0 100 100 0 0 100 100 B - Before; A - After; % - Percentage of microbial reduction In terms of the ozone activity from generator I, on the floor of all the rooms, there was a reduction in microbial load (CFU) and a negative count in room 1. The findings were the same for the counters, except for room 4, which maintained the same colony count before and after exposure to ozone. As for the walls, there was a 50% reduction in microbial contamination. In the ambient air analysis, contamination was reduced in seven rooms; in the other rooms no microorganisms were detected either before (B) or after (A) exposure to O3. The results obtained from the antimicrobial activity of the ozone gas with generator II are presented in Table 2. Once again, antimicrobial activity was evident, as shown by the reduction in CFU for all the variables examined, such as the air and surfaces, before and after exposure to O3 gas. The amount of CFU only remained constant in two rooms (4 and 9) for the two investigation periods. Regardless of the generators, microbial control was higher for the floor and counter areas. In addition, considering all the areas investigated, Mod. I and Mod. II had statistically significant differences (p<0.05). When assessed separately, in relation to each one of the surfaces and ambient air, the results were not significant except for the wall (p=0.0639) and counter (p=0.1267), respectively. It should be noted that generators I and II had distinct ozone gas flows and concentrations, i.e., 200 and 100 m3/h - 2.0 and 2.1 ppm of ozone gas, respectively. The temperature and humidity recordings of the rooms were 21ºC and 58% for the two investigation periods. Discussion This study has limitations associated with the study design (experimental-laboratory and cross-sectional). The environmental condition of the laboratory rooms was considered as a parameter of analysis and inference for the hospital environment. However, this does not detract from the importance of the research as a prototype for the evaluation of microbiological action, in two periods of investigation - before and after exposure to ozone. In this sense, the researchers sought to mimic the reality of environments, in terms of the occurrence of microorganisms present on surfaces and in the air, introduce the sanitization process and then develop environmental hygiene protocols. The practical applicability of O3 gas in hospital environments could improve microbiological conditions, and thereby prevent or help reduce HAI rates. Furthermore, the portable nature of the equipment makes the sanitization process mobile and feasible for monitoring specific hospital areas. It is known that O3 is part of the disinfection and sanitization routine of other environments,(22) with controls for bacteria and fungus.(15,17) However, this study expands what is already known about the gas, in that halting microbial growth or reducing the CFU count on Petri dishes after the application of O3 gas to any of the surfaces analyzed, compared to the control group, proves the effectiveness of the chemical compound in microbial control processes. Similar findings were reported in a study on the decontamination of operating rooms in a veterinary hospital.(14) The two studies clearly demonstrated the potential of O3 gas in environmental disinfection processes, since the decrease in the count of mesophilic aerobes, molds and yeasts occurred frequently. In terms of the microbial elimination process by O3 gas, it is known that cell destruction occurs through oxidation of structural elements, without specifying targets present in bacterial or fungal cells.(18) In this sense, multi-drug resistant organisms can be eliminated, with significant advantages, when compared with mechanical disinfection methods that use liquid disinfectants for environmental surfaces in healthcare facilities, including hospital environments, where it is common to use other chemical compounds in liquid form. Biological samples which indicate that environments or surfaces are probable reservoirs for HAI transmission are essential in epidemiological studies.(23,24) In hospitals, terminal cleaning is done in areas and surfaces close to or in contact with patients, after their departure, whether through their death, transfer or end of isolation,(24–27) and, despite efforts, disinfection and cleaning results are not always satisfactory.(28,29) The use of O3 gas in the study provided scientific proof regarding its microbial control potential, making it a compound that can be used as a sanitization procedure for healthcare environments. In this study, differences were noted between the two O3 generators in terms of antimicrobial potential under the same conditions in the sanitization of environments, particularly in relation to flow and output power of the devices. The results indicated significant differences for certain parameters; however, in general terms, the sanitization potential of the two models was nearly the same. Innovative protocols could be created to improve the antimicrobial pattern detected in the study. CFU values varied from one room to another. This shows that an environment does not always have the same microbiological conditions, which is to be expected considering hospital environments. Due to the demarcation of the areas investigated, before and after treatment with O3 gas, only a limited surface area was sampled, which does not ensure that the results would be the same throughout the extension of the surfaces. However, sanitization practices using ozone, generated by portable equipment, certainly enables implementation of new microbial control measures in hospital environments. The floor and counter surfaces had higher CFU counts and, at the same time, corresponded to the areas of greater microbial inhibition by ozone. Microbial particles are dense in relation to air, which normally contributes to the permanence of potential pathogens on the floors of nosocomial environments.(30) In this sense, portable equipment can be moved close to areas of high environmental contamination and reduce the microbial load. According to the literature, the antimicrobial effect of O3 depends on certain factors, such as exposure time, concentration, temperature and humidity.(31) However, in the current study, these criteria were assessed and maintained under equal experimental conditions, thereby minimizing possible biases. In this sense, other studies are needed that consider other parameters of temperature, relative humidity, concentration and exposure time. When inhaled in high concentration, O3 can be toxic and has respiratory health risks.(32) The two pieces of equipment tested generate a small amount of ozone (2.0 - 2.1 ppm) and, during their use, no one should remain in the environment. Little importance was given to the training of the group from the Surface Cleaning and Disinfection Service in Health Service, which plays an essential role in reducing HAI. Therefore, cleaning and disinfection practices for environments, equipment and surfaces must be part of Hospital Infection Control Committees, along with nursing and cleaning services, carrying out activities related to environmental hygiene protocols, supervision and training of teams.(33,34) Another important point in the utilization of technologies that do not use mechanical action for disinfecting environments and surfaces is that they do not ensure that adjacent areas will be disinfected. Nor do they replace mechanical cleaning and disinfection activities.(35) Finally, the search for new products or methods and hospital practices for disinfecting surfaces and reducing air microbiota through artificial cooling has been increasing over time, and ozone gas is a promising compound. There are still not many studies in the literature that address this object of research and those that do have highly varied experimental conditions, which suggests the need to create well-designed protocols for microbial control. Conclusion The findings of the present study demonstrate the antimicrobial potential of O3 gas, produced by two generators and according to the criteria set forth, ensure antimicrobial action. Applying ozone to environments is a practical procedure for sanitizing surfaces and artificially cooled air. It appears that this technology is feasible for use in various segments which seek to reduce microbial density. This resource could be used in protocols for sanitizing hospital environments and surfaces, due to its quick and easy execution and ability to control microbial development, an essential condition for maintaining microbiologically safe environmental quality. Acknowledgements This study was carried out with support from the Federal University of Mato Grosso do Sul (UFMS/MEC–Brazil) and the Coordination for the Improvement of Higher Education Personnel (CAPES) – Financing Code 001.