Inferência filogenética revela a complexa etiologia das manchas areolada e foliar em seringueira e em outras espécies cultivadas na Amazônia

Phylogenetic inference reveals the complex etiology of the target and leaf spot diseases on rubber tree and other species cultivated in the Amazon

FITOSSANIDADE

Inferência filogenética revela a complexa etiologia das manchas areolada e foliar em seringueira e em outras espécies cultivadas na Amazônia

Phylogenetic inference reveals the complex etiology of the target and leaf spot diseases on rubber tree and other species cultivated in the Amazon

Ana Paula da Silva de Campos Gaino^I; Marco Antonio Basseto^II; Luadir Gasparotto^III; Luiz Sebastião Poltronieri^IV; Paulo Cezar Ceresini^I,V,*

^IDepartamento de Fitossanidade, Engenharia Rural e Solos, Faculdade de Engenharia de Ilha Solteira, Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", Rua Monção, 226, 15385-000, Ilha Solteira, São Paulo, Brasil

^IIDepartamento de Defesa Fitossanitária, Faculdade de Ciências Agronômicas de Botucatu, Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", Botucatu, São Paulo, Brasil

^IIIEmpresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária, Embrapa Amazônia Ocidental, Manaus, Amazonas, Brasil

^IVEmpresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária, Centro de Pesquisa Agroflorestal da Amazônia Oriental, Embrapa Amazônia Oriental, Belém, Pará, Brasil

^VInstitute of Integrative Biology, Plant Pathology, ETH Zurich, Swiss Federal Institute of Technology, Zurich, Switzerland

RESUMO

A mancha areolada de Thanatephorus é uma das doenças mais importantes da seringueira (Hevea brasiliensis) na Amazônia brasileira. Além da seringueira, o fungo T. cucumeris (fase anamórfica Rhizoctonia solani) causa doenças foliares em outras espécies nativas ou cultivadas na região. Baseando-se na ausência de informações sobre quais os grupos de anastomose (AG) de R. solani estão associados à seringueira e a outros hospedeiros na Amazônia, testou-se a hipótese de que estes isolados pertencem a AG distintos. Também não há informação sobre a patogenicidade cruzada, à seringueira, de isolados provenientes de outros hospedeiros. A determinação do AG foi efetuada com base em análise filogenética da região ITS do rDNA. Concluiu-se que um novo subgrupo de R. solani (o AG-2-2 Hb) é o principal agente causal da mancha areolada em seringueira. Entretanto, isolados de outros AGs (AG-1 IB e ID, AG-4 HGI) e de Ceratobasidium sp. (Rhizoctonia sp. binucleada AG-R), oriundos de hospedeiros distintos, também infectam seringueira. Isto implica diversidade de fonte de inóculo para a sobrevivência e disseminação dos patógenos. De maneira inédita se relata a ocorrência de um novo AG de R. solani infectando citros no Acre, Brasil, distinto dos demais relatados no mundo (provavelmente AG-14).

Palavras-chave: Rhizoctonia solani, grupamento de anastomose, patogenicidade cruzada, seringueira, citrus.

ABSTRACT

Thanatephorus target spot is one of the most important diseases of the rubber tree (Hevea brasiliensis) in the Amazon region of Brazil. In addition to rubber tree, the fungus Thanatephorus cucumeris (anamorphase = Rhizoctonia solani) causes several foliar diseases on other agricultural crops or native species in the region. Based on the lack of information on which anastomosis groups (AG) of R. solani are associated with rubber tree and other hosts in the Amazon, we tested the hypothesis that these isolates belong to distinct AGs. There is no information about the cross pathogenicity (to rubber tree) of isolates from other hosts. The AG was determined based on phylogenetic analyses of the ITS region of the rDNA. We concluded that a new subgroup of R. solani (the AG-2-2 Hb) is the main pathogen causing the rubber tree leaf spot. However, isolates from other AGs (AG-1 IB and ID, AG-4 HGI) and from Ceratobasidium sp. (binucleate Rhizoctonia sp. AG-R) from distinct hosts can also infect the rubber tree. This implicates in diversity of inoculum sources for the survival and spread of the leaf spot pathogens. For the very first time, we report the occurrence of a new AG of R. solani infecting citrus in Acre, Brazil, which is distinct from all the others already described worldwide (probably AG-14).

Key words:Rhizoctonia solani, anastomosis grouping, cross pathogenicity, rubber tree, citrus.

Introdução

Em condições naturais, o fungo Basidiomiceto Thanatephorus cucumeris (Frank) Donk causa várias doenças foliares em culturas de importância agrícola e em espécies nativas na região da Amazônia brasileira (GASPAROTTO et al., 2001; LOURD et al., 1984; POLTRONIERI et al., 1999; TRINDADE; FURTADO, 1997; TRINDADE et al., 1997). Entre as doenças relatadas na Amazônia, a mancha areolada da seringueira [Hevea brasiliensis (Willd. ex A. Juss.) Müll. Arg. (1865)] é considerada uma das mais importantes (DESLANDES, 1944). O patógeno T. cucumeris tem como fase anamórfica Rhizoctonia solani Kühn, uma espécie complexa composta por vários grupos de anastomose (AGs) (CARLING, 1996). A espécie multinucleada R. solani é conhecida como patógeno de diversas plantas cultivadas (OGOSHI, 1987).

A mancha areolada da seringueira foi relatada pela primeira vez no Brasil, em 1943, no Pará (DESLANDES, 1944). Hoje é considerada a segunda enfermidade de maior impacto econômico para a seringueira, provocando lesões foliares que progridem para intensa desfolha em condições de viveiros, jardins clonais e plantas adultas (GASPAROTTO et al., 1997). Prejuízos em torno de 30% na produção de látex em seringais brasileiros foram relatados, nos anos de 1970, em função da incidência da mancha areolada (GASPAROTTO et al., 1997). A maioria dos clones brasileiros de seringueira é suscetível a essa enfermidade. (GASPAROTTO et al., 1982). Entretanto, na Costa Rica, há relato de resistência em H. brasiliensis (clones FB 54 e FB 3363), H. benthamiana (clones F 4515, F 4327 e F 4542), H. pauciflora e H. rigidifolia (CARPENTER, 1951).

Outro gênero (filogeneticamente próximo à Thanatephorus), considerado importante patógeno de uma série de plantas na Amazônia, é o Ceratobasidium spp. (BENCHIMOL et al., 2001; TRINDADE; FURTADO, 1997). Este patógeno causa a doença denominada mal-do-fio, que é peculiarmente distinta da mancha areolada (GASPAROTTO et al., 1997). Ceratobasidium tem como fase anamórfica espécies binucleadas de Rhizoctonia (SNEH et al., 1996). Muitas das espécies de Rhizoctonia binucleadas, entretanto, estão frequentemente associadas com controle biológico (BASSETO et al., 2008; CERESINI; SOUZA, 1997; SNEH et al., 1996).

O principal objetivo deste estudo foi elucidar aspectos importantes sobre a etiologia da mancha areolada em seringueira e em diversas outras espécies cultivadas ou nativas na região amazônica. O único relato clássico da literatura que trata da etiologia da mancha areolada data da década de 1980. (BOLKAN; RIBEIRO, 1985) determinaram que o AG-2 estava consistentemente associado à mancha areolada da seringueira. Naquela época, entretanto, apenas cinco AGs de R. solani haviam sido descritos mundialmente. Desde então, o AG-2 foi reclassificado em vários outros subgrupos de anastomose (AG-2-1, AG-2-2 IIIB, AG-2-2 IV, AG-2-2 LP, AG-2-3 e AG-2-4) e atualmente é considerado um grupo complexo e polifilético (CARLING et al., 2001). A real etiologia das manchas foliares em diversas outras espécies da Amazônia é desconhecida.

Neste estudo, foi testada a hipótese de que os isolados de T. cucumeris, provenientes da região amazônica e oriundos de seringueira e de outras espécies cultivadas ou nativas da região, pertencem a AGs distintos. Para isso, isolados de T. cucumeris, foram caracterizados filogeneticamente (baseando-se em sequências de bases da região ITS-5.8S do rDNA). Da mesma forma, não há informação sobre a patogenicidade cruzada de isolados provenientes de outras espécies cultivadas ou nativas da Amazônia para a seringueira. Assim, por meio de teste de patogenicidade cruzada, foi testada uma segunda hipótese de que isolados de T. cucumeris de hospedeiros distintos são patogênicos também à seringueira.

Acredita-se que a informação gerada por esta pesquisa oferece importante contribuição para o conhecimento da biologia de Thanatephorus sp. na região amazônica, com implicações importantes para o manejo da doença. Por exemplo, se comprovada a hipótese de que a seringueira é hospedeira de um complexo de patógenos do gênero Rhizoctonia, envolvidos com a mancha areolada, faz-se necessário selecionar clones resistentes a mais de um AG.

Material e métodos

Isolados. O material constituído de folhas infectadas naturalmente por T. cucumeris e/ou Ceratobasidium spp. foi coletado em Manaus (Estado do Amazonas). Esta primeira amostragem resultou em seis isolados de seringueira e um de Mimosa pigra L. Uma segunda amostra de T. cucumeris, causadora de mancha foliar em uma série de hospedeiros nativos ou cultivados, foi coletada em Belém, Estado do Pará. e em Rio Branco, Estado do Acre, em cooperação com pesquisadores da Embrapa - Amazônia Ocidental (Estado do Amazonas), Amazônia Oriental (Estado do Pará) e Acre. Esta amostra totalizou 15 isolados (Tabela 1). Por se tratar de amostras tão diversas, em termos de hospedeiros de origem, e provavelmente também quanto aos AGs dos isolados, optou-se pelo sequenciamento da região ITS-5,8S do DNA ribossomal nuclear (rDNA) como estratégia para determinação dos AGs, baseando-se em análise filogenética em relação à maioria dos AGs de R. solani e de Rhizoctonia spp. binucleados já descritos.

Isolamento do patógeno a partir de tecidos foliares infectados. Fragmentos de lesões foliares desinfestados superficialmente foram transferidos para meio de cultura ágar-água (AA) alcalino (pH 8,5) e incubados a 25ºC, na ausência de luz, por 24h. Os crescimentos miceliais característicos de Rhizoctonia spp. obtidos foram purificados em AA alcalino e, posteriormente, em meio de batata-dextrose-ágar (BDA) (TUITE, 1969). Os isolados purificados foram preservados em grãos de arroz parboilizado, segundo metodologia adaptada de (SNEH; ADAMS, 1996) e estocados à temperatura de -20ºC.

Determinação do AG, baseando-se em análise filogenética da região ITS-5,8S do rDNA. Para a caracterização filogenética, os isolados foram cultivados no meio de cultura de BDA + estreptomicina (0,050 g L^-1) por dois dias, a 25ºC. A extração de DNA genômico do micélio dos isolados de R. solani seguiu o protocolo de Kuramae-Izioka (1997). Procedeu-se amplificação da região ITS-5,8S do rDNA por meio de reações da polimerase em cadeia (PCR), utilizando-se condições descritas anteriormente . Amplificações iniciais foram efetuadas, usando-se o conjunto de iniciadores (primers) ITS4/ITS5. Cada produto de PCR foi purificado, utilizando-se colunas MicroSpin S-400 HR (Amersham Pharmacia), de acordo com instruções do fabricante.

Para o sequenciamento da região ITS do rDNA amplificada, foi utilizado kit pré-misturado para ciclo de sequenciamento, baseado em química de corante terminador (dye terminator cycle sequencing pre-mix kit) (Amershan Life Science). Cerca de 75 ng de DNA amplificado foram utilizados por reação e 1 µM de cada um dos iniciadores ITS4 ou ITS5 em reações independentes. Os produtos de sequenciamento foram separados em polímero de poliacrilamida a 6%, utilizando-se sequenciador automático PE Applied Biosystems ABI-377.

Clonagem dos produtos de PCR. Dada à condição predominante de heterocário no ciclo de vida de T. cucumeris, é comum observar heterogeneidade nas sequências de DNA em produtos de PCR não-clonados (CIAMPI et al., 2005). Para se separar diferentes alelos no operon ITS1-5.8S-ITS2, dentro de uma reação heterogênea de PCR, os amplicons/produtos da amplificação foram clonados dentro de um vetor PCR2.1-TOPO^® (Invitrogen, San Diego). Plasmídeos selecionados de Escherichia coli One Shot^® DH5a^TM-T1R recombinantes (Invitrogen, San Diego) foram extraídos de cada amostra e purificados por QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN^®). Foram usados primers iniciadores universal foward e reverse, para um dos múltiplos sítios de clonagem do vetor, visando re-amplificar e sequenciar os clones obtidos.

Análise de dados de sequências da região ITS-5.8S do rDNA. As sequências obtidas foram analisadas pelo programa phred/phrap/consed para determinação de qualidade (GORDON et al., 1998), alinhadas pelo programa computacional ClustalX (THOMPSON et al., 1997)e comparadas com sequências da região ITS do rDNA de todos os AGs de R. solani e Rhizoctonia spp. binucleadas, depositadas no banco de dados do GenBank^® (NCBI). A busca por sequências similares foi efetuada por BLASTN (nucleotídeo-nucleotídeo), versão 2.2.6 de 9/4/2003, disponível no site http://www.ncbi.nih.gov/BLAST (ALTSCHUL et al., 1997).

Análise filogenética. As relações filogenéticas entre haplótipos da região ITS-5.8S do rDNA dos isolados de T. cucumeris da seringueira e de outras plantas hospedeiras cultivadas ou nativas da Amazônia foram determinadas por meio de análise Bayesiana, usando-se o método de Monte Carlo - Cadeia de Markov, conjugado ao algorítmo de Metrópolis (MCMCMC), por meio do programa MrBayes v 2.01 (HUELSENBECK; RONQUIST, 2001). Para a análise de MCMCMC, Modeltest 3.7 (POSADA; CRANDALL, 1998), implementado no programa PAUP4* (SWOFFORD, 2002), foi utilizado para se determinar o modelo de substituição de bases de DNA que mais se ajustou aos dados. Um teste hierárquico da razão da verossimilhança, implementado no Modeltest, selecionou o modelo HKY + G como modelo de substituição de bases da região ITS-5.8S do rDNA dentro do complexo Thanatephorus/Rhizoctonia (proporção de sítios invariáveis = 0; frequência de bases A = 0,2713, C = 0,2228; G = 0,1336 e T = 0,3724; parâmetro da distribuição gama = 0,3138; razão T de transições/transversões = 1,9654). Sob este modelo evolutivo, o valor da máxima verossimilhança (ML) da árvore mais provável foi de –ln L 1972,64. Já para o complexo Rhizoctonia spp. binucleadas (Ceratobasidium spp.), o modelo de substituição de bases, selecionado pelo Modeltest, foi o K80 + G (proporção de sítios invariáveis = 0; frequência de bases = semelhante; parâmetro da distribuição gama = 3,3271; razão T de transições/transversões = 2,1843). Sob este modelo evolutivo, o valor de ML da árvore mais provável foi de –ln L 1621,18.

Patogenicidade de isolados à seringueira. A patogenicidade dos isolados de T. cucumeris e/ou Ceratobasidium spp. de seringueira e de diversos outros hospedeiros foi determinada no clone de seringueira RRIM 600. O inóculo foi preparado por meio do método de colonização de palitos de madeira com micélio de Rhizoctonia spp. Palitos de madeira esterilizados foram transferidos para culturas de isolados de Rhizoctonia spp. em meio de BDA e incubados por cinco dias a 25ºC, em ausência de luz. Palitos colonizados pelo micélio do fungo foram transferidos sobre folíolos jovens destacados de seringueira, próximos a ferimentos efetuados com alfinete esterilizado. Folíolos inoculados foram incubados em estufa biológica, por cinco dias, a 25ºC, sob fotoperíodo de 12h. Condição de câmara úmida foi obtida pela manutenção de algodão umedecido na base do folíolo e pelo envolvimento das placas em filme plástico. Observou-se a incidência de sintomas nos folíolos inoculados. O re-isolamento dos patógenos foi efetuado em uma das repetições de cada tratamento para confirmação de sua atuação como agentes casuais da doença. O experimento foi repetido duas vezes.

Resultados e discussão

Neste estudo, a determinação dos AGs dos isolados de Thanatephorus sp. e/ou Ceratobasidium spp., procedentes da seringueira e de uma série de outros hospedeiros, foi efetuada com base em análises filogenéticas. A inferência filogenética da região ITS-5,8S do rDNA de Thanatephorus sp. e de Ceratobasidium spp. é considerada uma ferramenta confiável na discriminação entre AGs (GONZALEZ et al., 2001).

No estudo das relações filogenéticas foram incluídas sequências de bases da região ITS-5,8S do rDNA da maioria dos AGs de R. solani (Thanatephorus sp.) e de Rhizoctonia spp. binucleadas (Ceratobasidium spp.) já descritos e depositados no banco de dados do NCBI/GenBank^®. Os haplótipos mundiais de Thanatephorus sp. determinados com base em sítios polimórficos, detectados ao longo da região ITS-5,8S do rDNA, estão apresentados na Tabela 2.

Já os haplótipos mundiais de Ceratobasidium spp. são apresentados na Tabela 3.

As relações filogenéticas, baseadas em análise Bayesiana (Figura 1e 2), entre haplótipos da região ITS-5,8S do rDNA, obtidos da amostra de distintos hospedeiros na Amazônia, indicaram que pelo menos cinco AGs de R. solani estão associados com manchas foliares nos seguintes hospedeiros: o AG 2-2 em seringueira (SER1 a SER9) e maracujazeiro (BEL88.1 e 2); o AG-1 IB em cafeeiro e repolho; o AG ID em maracujazeiro (isolado BEL59), feijão, vindicá e pimenta-do-reino; e o AG-4 HGI em capim Brachiaria, abóbora, urucum e jambu (Tabela 1; Figura 1).

Em citros, no Estado do Acre, detectou-se, pela primeira vez, a ocorrência de um provável novo AG de R. solani. Sintomas da infecção foliar, natural de plantas de Citrus sp. pelo patógeno, podem ser observados na Figura 3. Em citros, os primeiros relatos de epidemias causadas pela mancha areolada surgiram com a expansão de áreas de cultivo no Estado do Pará nos últimos anos (TRINDADE et al., 1997). Nesta cultura, o fungo afeta especificamente as espécies de laranjeira doce, não sendo observado ataque em limoeiros e tangerinas (TRINDADE et al., 1997). Muito pouco é relatado sobre esta doença em condições brasileiras e o potencial de expansão para outras regiões do Brasil é desconhecido.

A análise filogenética indicou posicionamento distinto dos haplótipos da região ITS-rDNA dos isolados de citros em relação aos demais AGs já descritos no mundo (Figura 1). O haplótipo associado aos isolados de Citrus sp. não apresentou relação filogenética com quaisquer dos AGs de Rhizoctonia spp. binucleadas (Figura 2). Deve-se considerar a possibilidade de se conferir uma denominação particular a este novo AG de R. solani (provavelmente AG-14), uma vez que os últimos grupos descritos foram o AG-12 e o AG-13 (CARLING et al., 2002; CARLING et al., 1999). Para tanto, é necessária a introdução destes dois isolados padrões em nosso laboratório no Brasil para então se determinar, por meio de interações microscópicas, que os isolados de Citrus não apresentam anastomose com nenhum dos grupos descritos mundialmente.

É a primeira vez que se descreve, no Brasil, a ocorrência do grupo de anastomose AG-1 ID em diversos hospedeiros. O AG-1 ID já havia sido relatado como patógeno do cafeeiro em Mindanao, nas Filipinas, em 1996 (PRIYATMOJO et al., 2001). Confirmou-se, também, pela análise filogenética (Figura 1), que os isolados de seringueira pertencem ao AG 2-2, como relatado por (BOLKAN; RIBEIRO, 1985). Entretanto, estes ocuparam um ramo distinto aos dos AG-2-2 IV, AG-2-2 LP e AG-2-2 IIIB. Isto é uma indicação de que, possivelmente, trata-se também de um novo subgrupo de anastomose dentro do complexo AG-2-2. Propomos a denominação deste novo subgrupo como a de AG-2-2 Hb.

A análise Bayesiana das relações filogenéticas entre haplótipos da região ITS-5.8S de todos os AGs de Rhizoctonia spp. binucleadas (Ceratobasidum spp.) indicou que o isolado binucleado de Rhizoctonia sp. de mimosa (M. pigra) pertence ao mesmo ramo do AG-R (Figura 2).

No teste de patogenicidade à seringueira, observou-se que todos os isolados desta planta induziram sintomas característicos de mancha areolada. Os isolados de R. solani, oriundos de uma série de hospedeiros distintos e pertencentes ao AG-1 IB e ID, AG-2-2, AG-4 HGI, bem como os isolados de Citrus e o isolado de Rhizoctonia sp. binucleada AG-R oriundo de mimosa, também foram patogênicos à seringueira RRIM 600 (Tabela 1; Figura 3).

O re-isolamento dos patógenos confirmou a sua atuação como agentes causais de mancha areolada. Baseando-se nos testes de patogenicidade cruzada, aceitou-se a segunda hipótese de que isolados de T. cucumeris de hospedeiros distintos são patogênicos também à seringueira.

Conclusão

Um novo subgrupo de R. solani (o AG-2-2 Hb) é o principal agente causal da mancha areolada em seringueira. Entretanto, isolados de outros AGs (AG-1 IB e ID, AG-4 HGI) e de Ceratobasidium sp. (AG-R), de hospedeiros distintos, também infectam seringueira. Isto implica diversidade de fonte de inóculo dos patógenos da mancha areolada. De maneira inédita se relata a ocorrência de um novo AG de R. solani infectando citros no Estado do Acre, Brasil, distinto dos demais relatados no mundo (provavelmente AG-14). Dado o complexo de patógenos do gênero Rhizoctonia envolvidos com a mancha areolada da seringueira, é necessário selecionar clones resistentes a mais de um AG.

Agradecimentos

Agradecemos à Fapesp pelo apoio financeiro, pela concessão de auxílio-pesquisa (a PC Ceresini, processo 04/02127-9) e Bolsa de Iniciação Científica (à APSC Gaino, processo 04/02127-9); à Capes pela concessão de bolsa de Pós-graduação (Mestrado) para a primeira autora; à Embrapa Amazônia Oriental, Amazônia Ocidental e Acre que nos ofereceram suporte logístico e laboratorial para coleta e isolamento de material e ao ETH Zurich por financiar parcialmente esta pesquisa (processo TH-16/06-1, a PC Ceresini) por meio do Convênio Unesp – ETH.

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Received on September 9, 2008.

Accepted on November 21, 2008.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  03 Mar 2011
• Data do Fascículo
  Set 2010

Histórico

• Aceito
  21 Nov 2008
• Recebido
  09 Set 2008