Este trabalho investigou a formação de um biofilme anaeróbio capaz de tratar vinhaça da produção de álcool de cana-de-açúcar, que evoluiu dentro de um reator operado em bateladas seqüenciais com biofilme (ASBBR) tendo a biomassa imobilizada em cubos de espuma de poliuretano na temperatura de 55ºC. O reator foi inoculado com lodo granular mesofílico tratando água residuária de abatedouro de aves. A evolução do biofilme nas matrizes de espuma de poliuretano foi observada durante sete fases experimentais que foram caracterizadas por mudanças nas concentrações de matéria orgânica como DQO (1,0 a 20,0 g/L). A caracterização da biomassa foi feita por exames de amostras do lodo em microscopia ótica e eletrônica de varredura. O reator apresentou grande diversidade de morfologias ao longo do experimento. A predominância de células como Methanosaeta foram observadas até a carga orgânica de 2,5 gDQO/L.d. Por outro lado, microrganismos como Methanosarcina foram a população arquéia predominante nas matrizes de espuma em taxas de carregamento orgânico acima de 3,3 gDQO/L.d. Este fato pode estar relacionado com maior taxa de utilização específica de acetato por esses microrganismos.