Santos, Angela Alves dos; Deoti, Junior Romeo; Müller, Gabriela; Dário, Marcelo Goulart; Stambuk, Boris Ugarte; Alves, Sérgio Luiz

doi:10.1590/1981-6723.11315

Angela Alves dos Santos

Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC), Centro de Ciências Biológicas, Departamento de Bioquímica, Florianópolis/SC - Brasil

Universidade Federal da Fronteira Sul (UFFS), Campus Chapecó, Chapecó/SC – Brasil

Junior Romeo Deoti

Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC), Centro de Ciências Biológicas, Departamento de Bioquímica, Florianópolis/SC - Brasil

Universidade Federal da Fronteira Sul (UFFS), Campus Chapecó, Chapecó/SC – Brasil

Gabriela Müller

Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC), Centro de Ciências Biológicas, Departamento de Bioquímica, Florianópolis/SC - Brasil

Marcelo Goulart Dário

Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC), Centro de Ciências Biológicas, Departamento de Bioquímica, Florianópolis/SC - Brasil

Boris Ugarte Stambuk

Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC), Centro de Ciências Biológicas, Departamento de Bioquímica, Florianópolis/SC - Brasil

Sérgio Luiz Alves Junior^**Sérgio Luiz Alves Junior, Universidade Federal da Fronteira Sul (UFFS), Campus Chapecó, Rodovia SC 484, km 2, Bairro Fronteira Sul, CEP: 89815-899, Chapecó/SC - Brasil, e-mail: slalvesjr@uffs.edu.br

Universidade Federal da Fronteira Sul (UFFS), Campus Chapecó, Chapecó/SC – Brasil

*Sérgio Luiz Alves Junior, Universidade Federal da Fronteira Sul (UFFS), Campus Chapecó, Rodovia SC 484, km 2, Bairro Fronteira Sul, CEP: 89815-899, Chapecó/SC - Brasil, e-mail: slalvesjr@uffs.edu.br

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Figura 1
Curvas de calibração com glicose (A, C) e frutose (B, D) pelo método proposto em microplacas (A, B) e pelo método clássico (tradicional) em tubos e com leitura individual em espectrofotômetro (C, D).

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Figura 2
Determinação das concentrações de glicose em amostras coletadas ao longo do crescimento celular de diferentes linhagens de leveduras de vinho colonial, através do método proposto em microplaca (●) e através de HPLC (□). Os códigos das linhagens são apresentados na parte superior central de cada gráfico. As barras de erro correspondem aos desvios padrões das duplicatas feitas em microplaca.

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Figura 3
Determinação das concentrações de frutose em amostras coletadas ao longo do crescimento celular de diferentes linhagens de leveduras de vinho colonial, através do método proposto em microplaca (●) e através de HPLC (□). Os códigos das linhagens são apresentados na parte superior central de cada gráfico. As barras de erro correspondem aos desvios padrões das duplicatas feitas em microplaca.

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Tabela 1
Parâmetros de validação parcial para linearidade, sensibilidade, limites de detecção e quantificação, calculados para o método em microplaca, para o método tradicional e para o método por HPLC.

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Tabela 2
Quantidade de reagente e de microplacas utilizados em diferentes métodos de dosagens de açúcares redutores com DNS em microescala^* * Considerou-se como microescala os ensaios realizados em microplacas de 96 poços – nos métodos que utilizam tubos, a dosagem requer quantidade de DNS que varia de 150,0 μL a 4.000,0 μL (SUMNER, 1921; SUMNER; SISLER, 1944; MILLER, 1959; LEUNG; THORPE, 1984; BREUIL; SADDLER, 1985; SCHWALD et al., 1988; HU et al., 2008; SAQIB; WHITNEY, 2011; DÁRIO, 2012; TEIXEIRA et al., 2012); .

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(1)

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(2)

	Sensibilidade		Linearidade		Limite de detecção (g/L)		Limite de quantificação (g/L)
	Glicose	Frutose	Glicose	Frutose	Glicose	Frutose	Glicose	Frutose
Método DNS microplaca	1,3840	1,3361	0,9999	0,9998	0,0390	0,0741	0,1301	0,2470
Método DNS tradicional	0,6232	0,6898	0,9990	0,9996	-	-	-	-
Método HPLC	2,4105 x 10⁵	2,5012 x 10⁵	0,9999	0,9999	2,6832 x 10^–8	3,1520 x 10^–8	8,9414 x 10^–8	1,0502 x 10^–7

Referência	Quantidade de DNS por poço (μL)	Nº de microplacas ^ Para um ensaio com 96 leituras;	Tempo de incubação na reação (min) ^* ***** Corresponde ao tempo destinado à redução do ácido 3,5-dinitrosalisílico pelo açúcar, para geração da cor.
Decker et al. (2003)DECKER, S. R.; ADNEY, W. S.; JENNINGS, E.; VINZANT, T. B.; HIMMEL, M. E. Automated filter paper assay for determination of cellulase activity. , Applied Biochemistry and BiotechnologyClifton, v. 105-108, p. 689-703, 2003.	150	2	10
Xiao et al. (2004)XIAO, Z.; STORMS, R.; TSANG, A. Microplate-based filter paper assay to measure total cellulase activity. , Biotechnology and BioengineeringNew York, v. 88, n. 7, p. 832-837, 2004.	120	2	5
Xiao et al. (2005)XIAO, Z.; STORMS, R.; TSANG, A. Microplate-based caborxymethylcellulose assay for endoglucanase activity. , Analytical BiochemistryNew York, v. 342, p. 176-178, 2005.	60	2	5
King et al. (2009)KING, B. C.; DONNELY, M. K.; BERGSTROM, G. C.; WALKER, L. P.; GIBSON, D. M. An optimized microplate assay system for quantitative evaluation of plant cell wall-degrading enzyme activity of fungal culture extracts. , Biotechnology and BioengineeringNew York, v. 102, n. 4, p. 1033-1044, 2009.	120	2	5
Gonçalves et al. (2010)GONÇALVES, C.; RODRIGUEZ-JASSO, R. M.; GOMES, N.; TEIXEIRA, J. A.; BELO, I. Adaptation of dinitrosalicylic acid method to microtiter plates. , Analytical MethodsLondon, v. 2, p. 2046-2048, 2010.	25	1	10
Navarro et al. (2010)NAVARRO, D.; COUTURIER, M.; DA SILVA, G. G.; BERRIN, J. G.; ROUAU, X.; ASTHER, M.; BIGNON, C. Automated assay for screening the enzymatic release of reducing sugars from micronized biomass. , Microbial Cell FactoriesLondon, v. 9, n. 1, p. 58, 2010. PMid:20637080. http://dx.doi.org/10.1186/1475-2859-9-58. http://dx.doi.org/10.1186/1475-2859-9-58...	60	2	10
Ramada et al. (2010)RAMADA, M. H. S.; LOPES, F. A. C.; ULHOA, C. J.; SILVA, R. N. Optimized microplate β-1,3 assay system for Trichoderma spp. screening. -glucanase, Journal of Microbiological MethodsAmsterdam, v. 81, n. 1, p. 6-10, 2010. PMid:20096308. http://dx.doi.org/10.1016/j.mimet.2010.01.010. http://dx.doi.org/10.1016/j.mimet.2010.0...	100	2	5
Negrulescu et al. (2012)NEGRULESCU, A.; PATRULEA, V.; MINCEA, M. M.; IONASCU, C.; VLAD-OROS, B. A.; OSTAFE, V. Adapting the reducing sugars method with dinitrosalicylic acid to microtiter plates and microwave heating. , Journal of the Brazilian Chemical SocietySão Paulo, v. 23, n. 12, p. 2176-2182, 2012. http://dx.doi.org/10.1590/S0103-50532013005000003. http://dx.doi.org/10.1590/S0103-50532013...	100	1	4
Wood et al. (2012)WOOD, I. P.; ELLISTON, A.; RYDEN, P.; BANCROFT, I.; ROBERTS, I. N.; WALDRON, K. W. Rapid quantification of reducing sugars in biomass hydrolysates: improving the speed and precision of the dinitrosalicylic acid assay. , Biomass and BioenergyOxford, v. 44, p. 117-121, 2012.	171	2	1
Kim et al. (2014)KIM, J. J.; KWON, Y. K.; KIM, J. H.; HEO, S. J.; LEE, Y.; LEE, S. J.; SHIM, W. B.; JUNG, W. K.; HYUN, J. H.; KWON, K. K.; KANG, D. H.; OH, C. Effective microwell plate-based screening for microbes producing cellulose and xylanase and its application. , Journal of Microbiology and BiotechnologyOxford, v. 24, n. 11, p. 1559-1565, 2014. PMid:25085570. http://dx.doi.org/10.4014/jmb.1405.05052. http://dx.doi.org/10.4014/jmb.1405.05052...	160	1	10
Novo método proposto	25	1	5

^*
Considerou-se como microescala os ensaios realizados em microplacas de 96 poços – nos métodos que utilizam tubos, a dosagem requer quantidade de DNS que varia de 150,0 μL a 4.000,0 μL (SUMNER, 1921SUMNER, J. B. Dinitrosalicylic acid: a reagent for the estimation of sugar in normal and diabetic urine. , The Journal of Biological ChemistryBaltimore, v. 47, p. 5-9, 1921.; SUMNER; SISLER, 1944SUMNER, J. B.; SISLER, E. B. A simple method for blood sugar. , Archives of BiochemistryNew York, v. 4, p. 333-336, 1944.; MILLER, 1959MILLER, G. L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. , Analytical ChemistryWashington, v. 31, n. 3, p. 426-428, 1959.; LEUNG; THORPE, 1984LEUNG, D. W. M.; THORPE, T. A. Interference by EDTA and calcium ions of the 3,5-dinitrosalicylate reducing sugar assay. , PhytochemistryLondon, v. 23, n. 12, p. 2949-2950, 1984.; BREUIL; SADDLER, 1985BREUIL, C.; SADDLER, J. N. Comparison of the 3,5-dinitrosalicylic acid and Nelson-Somogyi methods of assaying for reducing sugars and determining cellulase activity. , Enzyme and Microbial TechnologyNew York, v. 7, p. 327-332, 1985.; SCHWALD et al., 1988SCHWALD, W.; CHAN, M.; BREUIL, C.; SADDLER, J. N. Comparison of HPLC and colorimetric methods for measuring cellulolytic activity. , Applied Microbiology and BiotechnologyBerlin, v. 28, p. 398-403, 1988.; HU et al., 2008HU, R.; LIN, L.; LIU, T.; OUYANG, P.; HE, B.; LIU, S. Reducing sugar content in hemicellulose hydrolysate by DNS method: a revisit. , Journal of Biobased Materials and BioenergySanta Clarita, v. 2, n. 2, p. 156-161, 2008. http://dx.doi.org/10.1166/jbmb.2008.306.
http://dx.doi.org/10.1166/jbmb.2008.306... ; SAQIB; WHITNEY, 2011SAQIB, A. A. N.; WHITNEY, P. J. Differential behaviour of the dinitrosalicylic acid (DNS) reagent towards mono- and di-saccharide sugars. , Biomass and BioenergyOxford, v. 35, p. 4748-4750, 2011.; DÁRIO, 2012DÁRIO, M. G. . Efeito da alteração na captação de sacarose ao metabolismo de Saccharomyces cerevisiae2012. 154 f. Tese (Doutorado em Biotecnologia)-Universidade de São Paulo, São Paulo, 2012.; TEIXEIRA et al., 2012TEIXEIRA, R. S. S.; SILVA, A. S.; FERREIRA-LEITÃO, V. S.; BON, E. P. S. Amino acids interference on the quantification of reducing sugars by the 3,5-dinitrosalicylic acid assay mislead carbohydrase activity measurements. , Carbohydrate ResearchAmsterdam, v. 363, p. 33-37, 2012.);
^**
Para um ensaio com 96 leituras;
^***
Corresponde ao tempo destinado à redução do ácido 3,5-dinitrosalisílico pelo açúcar, para geração da cor.

[1] *Sérgio Luiz Alves Junior, Universidade Federal da Fronteira Sul (UFFS), Campus Chapecó, Rodovia SC 484, km 2, Bairro Fronteira Sul, CEP: 89815-899, Chapecó/SC - Brasil, e-mail: slalvesjr@uffs.edu.br

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Microwell plate-based method for the determination of reducing sugars with the DNS reagent

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