Alta atividade de PI3K/mTOR e baixa atividade de MAPK/JNK resultam em diminuição da apoptose e autofagia na polipose nasal^☆

Resumo

Introdução:

A polipose nasal é uma doença inflamatória progressiva que reduz a qualidade de vida dos pacientes. Os efeitos das vias apoptóticas e autofágicas na patogênese da polipose nasal ainda não são claramente conhecidos.

Objetivo:

Investigar as vias apoptóticas MAPK/JNK, antiapoptóticas PI3K/mTOR e autofágicas LC3 as quais se encontram relacionadas entre si, nos tecidos da polipose nasal.

Método:

Vinte pacientes com pólipos nasais e 15 pacientes submetidos a redução de conchas nasais inferiores foram incluídos. Pacientes com asma, tríade de Samter e sinusite fúngica alérgica foram excluídos. As vias apoptóticas e autofágicas foram investigadas em cortes de tecido nasal embebidos em parafina de 20 amostras de polipose nasal e 15 de amostras provenientes de redução de conchas nasais inferiores com H&E e imuno-histoquímica com h-escore. O método TUNEL com índice apoptótico foi usado para demonstrar células apoptóticas.

Resultados:

Imunorreatividade diminuída de P38 MAPK (p <0,005) e JNK (p <0,005) foi observada na polipose nasal comparada à de tecidos oriundos de redução de conchas nasais inferiores. Essa diminuição pode indicar uma down-regulação da apoptose, como demonstrado pela diminuição da coloração de TUNEL na polipose nasal (p <0,005). A imunorreatividade de PI3K (p <0,002) e mTOR (p <0,005) estava aumentada na polipose nasal. Esse aumento indica uma down-regulação da autofagia, como demonstrado pela diminuição da coloração de LC3 na polipose nasal (p <0,001).

Conclusão:

Apoptose e autofagia deficientes através das vias MAPK/JNK e PI3K/mTOR podem ter um papel na patogênese da polipose nasal.

PALAVRAS-CHAVE
Pólipo nasal; Apoptose; Autofagia; TUNEL; Eosinófilo

Abstract

Introduction:

Nasal polyposis is a progressive inflammatory disease that reduces the quality of life. The role of apoptotic and autophagic pathways in nasal polyposis pathogenesis is not yet clearly known.

Objective:

In this study we aimed to investigate apoptotic (MAPK/JNK), anti-apoptotic (PI3K/mTOR) and autophagic (LC3) pathways which are related each other in the nasal polyposis tissues.

Methods:

Twenty patients with nasal polyps and fifteen patients going through an inferior turbinate reduction were included in this study. Patients with asthma, Samter triad and allergic fungal sinusitis were excluded from the study. The apoptotic and autophagic pathways were investigated in paraffin-embedded nasal tissue sections of 20 NP and 15 samples from inferior turbinate reduction by H&E and immunohistochemistry with h-score. TUNEL method with apoptotic index was used to demonstrate apoptotic cells.

Results:

Decreased immunoreactivity of P38 MAPK (p <0.005) and JNK (p <0.005) were observed in nasal polyposis compared to material from inferior turbinate reduction. This decrease may indicate a downregulation of apoptosis as demonstrated by decreased TUNEL staining in nasal polyposis (p <0.005). The PI3K (p <0.002) and mTOR (p <0.005) immunoreactivities were increased in nasal polyposis. This increase indicates a downregulation of autophagy as demonstrated by decreased LC3 staining in nasal polyposis (p <0.001).

Conclusion:

Deficient apoptosis and autophagy through MAPK/JNK and PI3K/mTOR pathways may have a role in the pathogenesis of nasal polyposis.

KEYWORDS
Nasal polyp; Apoptosis; Autophagy; TUNEL; Eosinophil

Introdução

Os pólipos nasais (PNs), lesões benignas que surgem principalmente nas mucosas do nariz e dos seios paranasais, são uma doença comum, com alta taxa de recorrência.¹ Ape- sar da morbidade significativa dessa doença recorrente, os mecanismos centrais da patogênese da polipose nasossinusal são complexos e mal compreendidos.

Supõe-se que os PNs sejam caracterizados por alterações morfológicas, como hiperplasia e metaplasia do revestimento epitelial, infiltração de células inflamatórias e fibrose estromal e edema.² Acredita-se que muitas citocinas e qui- miocinas tenham uma grande contribuição na patogênese dos PNs.³ Por exemplo, os eosinófilos são as células infla- matórias mais comuns.⁴ Pesquisas anteriores demonstraram que o aumento da síntese de colágeno devido à inibição da apoptose dos eosinófilos é um fator que contribui para o desenvolvimento de pólipos.⁵ Além disso, alguns pesquisa- dores relataram que a apoptose nas células inflamatórias é um fator importante na resolução dos PNs.⁶ Portanto, a apoptose tem um papel na remoção de células indesejadas associadas aos PNs. Além disso, estudos recentes sugeriram que a apoptose celular tardia tem um papel importante na patogênese dos PNs.⁷ Nesse sentido, mostrar a via apoptó- tica verdadeira pode ajudar a impedir a formação de PNs.

Por outro lado, a autofagia é um processo altamente específico para mitigar vários tipos de estresse celular. Nesse processo, o conteúdo citoplasmático é sequestrado, transportado por autofagossomo de membrana dupla para os lisossomos e degradado. Várias vias são responsáveis por regular a apoptose e a autofagia. As proteínas quinases ativadas por mitogênio (MAPKs, do inglês Mitogen-Activated Protein Kinases) desempenham um papel importante na regulação de muitos processos celulares, inclusive proliferação, diferenciação e apoptose celular. As MAPKs consistem em MAPKs ativadas por estresse, quinases de c-Jun NH2-terminal (JNKs) e MAP38 p38,⁸ o que significa que uma baixa atividade de MAPK/JNK suprime a apoptose. Por outro lado, as vias MAPK, a via de transdução de sinal fosfatidilinositol 3-quinase/alvo da rapamicina,P13K/mT, em mamíferos, uma molécula sinalizadora para síntese de proteínas e sobrevivência celular são ativadas e inibem a autofagia,⁹ o que significa que uma alta atividade de PI3K/mTOR suprime a autofagia.

Também foi relatado que a molécula LC3 interage com a via mTOR na formação da membrana autofagossômica.¹⁰ A LC3-II está localizado na membrana dos autofagossomos quando a autofagia é ativada e a LC3-II aumenta diretamente proporcional ao número de autofagossomos.¹¹

A autofagia e a apoptose são os importantes reguladores do destino celular. Essa regulação as torna importantes na doença inflamatória. Não há consenso sobre o papel desses dois mecanismos na fisiopatologia dos PNs. O objetivo deste artigo é investigar o papel das vias apoptótica e relacionada à autofagia, como MAPK/JNK, PI3K/mTOR e LC3 na fisiopatologia dos PNs.

Método

Pacientes e tecidos

O estudo foi aprovado pelo Izmir Katip Celebi University Atatürk Education and Research Hospital. O consentimento informado foi obtido de cada paciente e o estudo foi aprovado pelo comitê de ética da Izmir Katip Celebi University sob o número 192/13. O estudo incluiu 20 pacientes com PN e 15 tecidos de concha nasal (TCN) e a faixa etária foi de 18 a 55 anos. Além disso, pacientes com sinusite fúngica alérgica, asma, intolerância ao AAS e tríade de Samter não foram incluídos no estudo. Os pacientes recrutados não usaram esteroides sistêmicos ou tópicos, nem tomaram outro medicamento sistêmico por pelo menos quatro semanas antes da cirurgia. Amostras de PNs foram coletadas de pacientes submetidos a biópsia de pólipo por via endoscópica para fins de diagnóstico e amostras de tecido de conchas nasais (TCN)¹,³,¹²,¹³ foram coletadas de pacientes submetidos a ressecção das conchas nasais devido à a hipertrofia compensatória de conchas secundária a desvio do septo nasal.

H&E e imuno-histoquímica

Todas as amostras foram fixadas em formalina a 10% por 24 horas e processadas para ser embebidas em parafina, com o protocolo de rotina. Cortes de 5 m de espessura foram obtidos e corados com hematoxilina e eosina (H&E). Também foram usados cortes adicionais para coloração imuno-histoquímica. As amostras de tecido foram armazenadas a 60^◦C durante a noite e depois foram desparafinadas com xileno por 30 minutos. Os tecidos foram então tratados com 2% de tripsina e incubados em solução de H₂O₂ a 3%. Em seguida, os cortes foram incubados com anticorpos primer anti-p38MAPK (sc-7973, Santa Cruz Biotechnology, Inc.), anti-JNK (sc-7345, Santa Cruz Biotechnology, Inc.), anti-PI3K (sc-1637, Santa Cruz Biotechnology, Inc.), anti-mTOR (sc-8319, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) e LC3 (LC3B, NB100-2220, Novus Biologicals, Littleton, CO, EUA) em uma diluição de 1/100 por 18 horas a +4^◦C. Após a administração do anticorpo secundário, os cortes foram corados com o sistema de substrato DAB que continha diaminobenzidina (DAB-plus substrate kit, Invitrogen) para detectar a imunorreatividade. Eles foram examinados de forma cega por microscopia óptica (Olympus BX-43, Tóquio, Japão).

Duas áreas selecionadas aleatoriamente foram escolhidas e, nas secções em que toda a coloração parecia intensa, um campo aleatório foi escolhido. Foram marcadas pelo menos 100 células por campo X40 para cada tecido em todos os grupos. Todas as secções foram escolhidas de maneira semiquantitativa, consideraram-se a intensidade e a porcentagem de coloração celular. As intensidades foram classificadas em leve (1+), moderada (2+), forte (3+) e muito forte (4+). A coloração dos antibióticos primer foi graduada de maneira semiquantitativa e o escore H foi calculado com a seguinte equação: Escore H = ∑Pi (i+1), onde i = intensidade da coloração com valores 1, 2, 3 e 4 (leve, moderado ou forte, muito forte) e Pi é a porcentagem de células coradas para cada intensidade, varia de 0 a 100.¹⁴,¹⁵

Método TUNEL

Para distribuição das células apoptóticas, foi usada a técnica de Terminal Deoxynucleotidyl Transferase Mediated dUTP Nick End Labeling (TUNEL), de acordo com o procedimento do fabricante do kit (S7101, ApopTag, Millipore). Após todas as etapas, a montagem foi feita com Entellan e elas foram examinadas independentemente por dois histologistas e as células, TUNEL-positivas ou não, foram contadas em campos escolhidos aleatoriamente para cada caso. Foi determinado o índice apoptótico como a porcentagem de células TUNEL-positivas com imunocoloração marrom positiva. Dois observadores cegos para a atribuição do tratamento avaliaram as pontuações de coloração de forma independente.

Figura 1
Fotomicrografias da coloração com hematoxilina e eosina nos tecidos controle (A) e PN (B). (Ep, epitelial; PV, plexo venoso; GN, hlândulas nasais; Seta, eosinófilos) (Ampliação original × 200).

Figura 2
Fotomicrografias de JNK e coloração para mTOR nos tecidos de conchas nasais (A, B) e PNs (C, D). (Ampliação original × 200).

Análise estatística

A homogeneidade dos dados foi avaliada pelo teste de Shapiro-Wilk. Para dados normalmente distribuídos, foi usado o teste t de Student; caso contrário, usamos o teste ×2 ou o teste U de Mann-Whitney. O software SPSS (versão 16) foi usado para todas as análises estatísticas. O nível de significância estatística foi estabelecido em p = 0,05 e foram determinados intervalos de confiança de 95%.

Resultados

Histologia dos tecidos nasais

As amostras de tecidos nasais coradas com hematoxilina e eosina são apresentadas na figura 1. Nas amostras de tecido de conchas, o plexo venoso submucoso e as glândulas nasais são demonstradas (fig. 1A). A formação de PNs é caracterizada histologicamente por edema submucoso e acúmulo de matriz extracelular (fig. 1B). Além disso, nos PNs, a infiltração celular na submucosa, especialmente as células eosinófilas, foi significativamente maior do que no tecido de concha nasal, onde foram observadas lesões epiteliais (fig. 1B).

Avaliação imuno-histoquímica – Apoptótica e autofágica

Estudos imuno-histoquímicos em 35 secções adicionais de tecido nasal embebido em parafina revelaram a localização dos marcadores relacionados à apoptose e a relação entre a expressão proteica e os tecidos de PNs.

As imunorreatividades positivas foram determinadas nas partes epitelial e estromal de todos os tecidos. Exemplos de coloração imuno-histoquímica são mostrados na figura 2. A imunorreatividade anti-JNK foi diminuída e a imunorreatividade mTOR estava aumentada em PNs (fig. 2).

Para o anticorpo primário P38 MAPK, a coloração imuno-histoquímica foi moderada e imunorreatividades leves a moderadas de anti-PI3K foram encontradas nos PNs.

Figura 3
Fotomicrografias de coloração de LC3 nos tecidos de RCI (A) e PNs (B). (Ampliação original × 200).

Um marcador autofágico, a imunorreatividade de LC3estava diminuída nos PNs em relação ao grupo controle(fig. 3).

Como resultado da coloração do método Terminal Deoxy-nucleotidyl Transferase Mediated dUTP Nick End Labeling(TUNEL), para avaliar a presença de células apoptóticas efragmentações de DNA nuclear nos pacientes, a média decélulas positivas para TUNEL encontradas foi moderada paratecido de concha nasal (fig. 4A) e negativa a fraca para PNs(fig. 4B). Além disso, detectamos que, além de o número dascélulas apoptóticas ser menor nos tecidos de PNs, a apop-tose não foi encontrada nos eosinófilos ou nas outras célulasinflamatórias (fig. 4B). figura 5, figura 6

As intensidades de coloração positiva de P38 MAPK, JNK,PI3K, mTOR, LC3 e TUNEL no TCN e nos tecidos nasais estãoresumidas na tabela 1.

Os resultados da análise mediana da coloração estãoresumidos nas figuras 5 e 6.

Discussão

Neste estudo, demonstramos que a diminuição das expres-sões das vias P38/MAPK, JNK e LC3 e o aumento da expressãodas vias PI3K e mTOR podem estar relacionados à down--regulação da apoptose e autofagia nos PNs.

A apoptose é a morte celular programada, na qual as célu-las inúteis, danificadas irreparavelmente ou indesejadas sãoeliminadas durante o desenvolvimento.¹⁶ A autofagia é umprocesso fisiológico normal no corpo envolvido na homeos-tase celular e nos mecanismos de sobrevivência nas célulascom respiração normal.¹⁷ Embora se saiba pouco sobre opapel da autofagia em doenças respiratórias, como rinitealérgica e sinusite,18não há consenso na literatura sobre opapel da autofagia e apoptose na fisiopatologia dos PNs.

Chen et al. estudaram a expressão da proteína LightChain 3 (LC3), um indicador comum da autofagia, e a expres-são da proteína quinase B – alvo mecanístico da rapamicina(Akt-mTOR) em amostras de tecido fresco de 5 póliposnasais e 6 mucosas nasais normais.³ Eles observaram quea expressão de LC3 estava diminuída e a atividade de Akt--mTOR aumentada em PNs. Wang et al. também relataramdiminuição da autofagia.¹⁹ Em seu estudo, eles verifica-ram que a expressão de LC3 estava diminuída, enquanto aexpressão de COX-2 estava significantemente aumentada emtecidos frescos de PNs em comparação com o controle demucosa normal. A autofagia era deficiente nos tecidos dePNs e a COX-2 era regulada negativamente pela autofagianos fibroblastos derivados de PNs.

Em outro estudo, Qi et al. sugeriram que as expressõesde Beclin1 e LC3 nos tecidos de pólipo nasal eram menoresdo que a expressão da mucosa de concha inferior.²⁰

Ao contrário, Shun et al. relataram que a expressão deHIF-1α, LDH e LC3II estava aumentada em amostras de póli-pos nasais. Eles concluíram que a análise de seus dadosindicava que a hipóxia pode contribuir para a formação doPNs ao promover a autofagia nos fibroblastos dos PNs.²¹ Wang et al. relataram que a expressão das proteínas auto-fágicas LC3 estava aumentada nos tecidos dos pólipos e avia de sinalização da apoptose extrínseca era notavelmenteativada nas células epiteliais de PNs.²²

Küpper et al. investigaram a expressão do mRNA dosmediadores da apoptose, como caspase 3, 7 e 9, e da pro-teína p53 analisada com a reação em cadeia da polimerasevia transcriptase reversa quantitativa em 25 PNs e 18 amos-tras de controle. Eles relataram a expressão reduzida de p53 com caspase 3 e 9 em pacientes com RSCcPNs (rinossinusite crônica com PNs) comparados aos dos controles. Eles concluíram que a expressão reduzida desses fatores de apoptose na RSCcPNs pode estar relacionada à maior proliferação e à perpetuação de células inflamatórias.²³ Em nosso estudo, observamos apoptose e autofagia diminuídas em amostras de PNs em comparação com amostras de TCN.

Figura 4
Fotomicrografias de coloração TUNEL nos tecidos de conchas nasais (A) e PNs (B). As células TUNEL-positivas foram identificadas pela coloração marrom (estrela) (Seta: eosinófilos) (A, B; ampliação original × 400).

Figura 5
H-escore de amostras de pólipo nasal (PN) e tecido de redução de concha inferior (RCI).

Tabela 1
Porcentagem de células positivas para coloração em pólipos nasais (PNs) e tecido de conchas nasais (TCN)

	P38 Mapk	JNK	PI3K	mTOR	LC3	Tunel
PNs	Moderado p < 0,005	Fraco/Moderado p < 0,005	Leve/Moderado p < 0,002	Forte p < 0,005	Forte p < 0,001	Negativo/Fraco p < 0,005
TCN	Forte	Forte	Negativo	Moderado	Leve/Moderado	Moderado

Por outro lado, em anos anteriores, houve aumento do número de estudos que mostraram o papel do estresse oxidativo na patogênese da polipose nasal.²⁴ MAPKs é a principal via de transdução de sinal sensível ao estresse oxidativo e intracelular.²⁵ Portanto, a expressão de MAPK pode ser um dos principais determinantes da apoptose nos PNs.

Além da imuno-histoquímica, investigamos as células apoptóticas pelo método TUNEL. A porcentagem de células positivas para TUNEL encontradas estava diminuída nos PNs comparadas ao tecido de concha nasal. Particularmente, não houve apoptose nos eosinófilos nos tecidos de PNs. O eosinófilo é a principal célula responsável pela fisiopatologiados PNs.²⁶ Em situações patológicas, a produção de eosinófilos é aumentada e essas células migram para os tecidos inflamados, nos quais se acredita que sua vida útil aumente através de uma combinação de mediadores inflamatórios e alterações no microambiente local.²⁷ A remoção de eosinófilos do tecido polipoide ocorre através da apoptose.²⁸

Os eosinófilos têm funções citotóxicas, como a liberação de proteínas básicas importantes, a peroxidase eosinofílica e a proteína catiônica eosinofílica, que causam danos aos tecidos e a eosinofilia aumenta a probabilidade de doença recorrente.²⁹ Khalmuratova et al. testaram a wogo- nina (5,7-di-hidroxi-8-metoxiflavona) em PNs e sugeriram que a wogonina atenua a formação de pólipos nasais ao induzir apoptose por eosinófilos.³⁰ Em outro estudo, a expressão de PARP e caspase 8 estavam aumentadas nos tecidos de PNs tratado com bleomicina e os tecidos diminuíram e depois desapareceram.³¹

Figura 6
Índice apoptótico por TUNEL em pólipo nasal (PN) e amostras de redução de concha inferior (RCI).

Esses resultados mostram que o aumento da expressão de moléculas antiapoptóticas diminuiu a expressão de moléculas pró-apoptóticas e autofágicas nos PNs e, principalmente, a ausência da apoptose nas células eosinofílicas nos PNs pode ser fator contribuinte para o desenvolvimento de pólipos.

Limitações

Usamos métodos imuno-histoquímicos em vez de testes de expressão gênica e western blot, que são quantitativos. Para diminuir a subjetividade dos resultados, dois observadores cegos avaliaram os resultados conforme descrito nos métodos.

Conclusão

Apoptose, eosinofilia e hiperproliferação são os principais processos celulares na polipose nasal e essas proteínas podem participar e desempenhar alguns papéis importantes para a obtenção de novas informações sobre essa doença e direcionamento de protocolos de tratamento.

• Financiamento
  Coordenação de Projetos e Pesquisa Científica da Izmir Katip C¸elebi University (n^◦ 2013-3-TSBP-16).

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  29 Set 2021
• Data do Fascículo
  2021

Histórico

• Recebido
  2 Maio 2019
• Aceito
  10 Dez 2019
• Publicado
  15 Jan 2020