Bactérias ácido láticas para inibir a produção de biofilme de Salmonella Heidelberg em superfícies de poliestireno

Resumo

Salmonella spp. é uma das principais causas de gastroenterite em todo o mundo. Salmonella Heidelberg é um patógeno emergente associado com surtos com multirresistência antimicrobiana vinculados aos produtos avícolas. A sua alta persistência no ambiente pode estar associada com sua habilidade de aderir a diferentes superfícies e formar biofilmes. Devido ao aumento da resistência antimicrobiana em todo o mundo, os pesquisadores têm investigado o uso de bactérias acido láticas (BAL) como um controle biológico e de microrganismos patogênicos. O objetivo deste estudo foi avaliar a habilidade de BAL no controle de biofilmes produzidos por S. Heidelberg em placas de poliestireno. Foi avaliada a atividade antimicrobiana in vitro de nove BAL, todas pertencentes ao gênero Lactobacillus, na inibição e na remoção de biofilmes produzidos por S. Heidelberg. A formação de biofilme só ocorreu quando a BAL1 (Lactobacillus salivaris) foi utilizada. Todos os outros tratamentos demonstraram atividade antimicrobiana. Entretanto, a BAL não foi capaz de reduzir a contagem bacteriana. Os resultados obtidos demonstram que BAL são capazes de prevenir ou retardar a formação de biofilme por S. Heidelberg em superfícies de poliestireno e podem ser utilizadas em estudos in vivo para determinar o seu potencial alternativo no controle deste patógeno na indústria de alimentos.

Palavras-chave:
prevenção de biofilmes; adesão; bactérias ácido láticas; Salmonella Heidelberg

Abstract

Salmonella spp. is one of the leading causes of gastroenteritis worldwide. Salmonella Heidelberg is an emergent pathogen associated with multidrug-resistant outbreaks linked to poultry products. Their high persistence in the environment may be associated with their ability to adhere to different surfaces and form biofilms. Owing to increased antimicrobial resistance worldwide, researchers have investigated the use of lactic acid bacteria (LAB) as a biological control against pathogenic microorganisms. This study aimed to evaluate the ability of LAB to control the formation of S. Heidelberg biofilms on polystyrene surfaces. The antibiofilm activity of nine LAB strains, all belonging to Lactobacillus genera, related to the inhibition of biofilms produced by S. Heidelberg was evaluated in vitro. All treatments, except LAB1 (Lactobacillus salivaris), showed antibiofilm activity. However, LAB did not reduce bacterial counts. Our results show that LAB can avoid or delay biofilm formation by S. Heidelberg on polystyrene surfaces and may be used for in vivo studies as a potential alternative to help control this pathogen in food industries.

Keywords:
biofilm prevention; adhesion; lactic acid bacteria; Salmonella Heidelberg

1. Introdução

Doenças transmitidas por alimentos permanecem como uma ameaça à saúde pública, e Salmonella spp. é uma das principais causas de gastroenterite em todo o mundo(¹). Surtos de salmonelose estão frequentemente associados ao consumo de produtos avícolas(²). Apesar da ampla variedade de sorovares de Salmonella existentes, Salmonella Heidelberg tem se destacado devido a sua alta frequência de isolamento. A emergência de S. Heidelberg, um importante patógeno associado com multirresistência antimicrobiana, tem sido observado com frequência em surtos envolvendo o consumo de produtos avícolas na América do Norte e na América do Sul, especialmente no Canadá, Estados Unidos e Brasil(³, ⁴, ⁵). Além da multirresistência antimicrobiana, isolados de S. Heidelberg têm a capacidade de aderir a diferentes superfícies e formar biofilmes, tornando mais difícil o seu controle(⁶, ⁷, ⁸). A sua alta persistência no ambiente da indústria produtora de carnes tem sido associada com a ocorrência de surtos e tem aumentado a preocupação entre as companhias produtoras desta proteína(⁹,¹⁰).

Biofilmes são definidos como populações microbianas que se aderem umas às outras e também a uma superfície biótica ou abiótica, sendo protegidas pela substância polimérica extracelular (EPS)(¹¹, ¹²). Estas estruturas tornam as bactérias mais resistentes aos desinfetantes e aos processos de desinfecção, desempenhando um papel crucial na sobrevivência de Salmonella em condições ambientais desfavoráveis, inclusive em abatedouros-frigoríficos(¹², ¹³). Devido ao aumento da resistência de biofilmes de Salmonella aos desinfetantes e aos antimicrobianos, é importante desenvolver estratégias eficazes e alternativas para prevenir a formação destas estruturas em ambientes relacionado à produção de alimentos(¹²). Desta forma, alguns pesquisadores têm investigado o uso de bactérias ácido láticas (BAL) e bactérias probióticas como controles biológicos de microrganismos patogênicos(¹⁴, ¹⁵, ¹⁶). BAL são caracterizadas pela produção de ácido lático como o principal catabólito final da glicose. Estas bactérias estão incluídas no grupo de probióticos, microrganismos vivos que conferem benefícios à saúde do hospedeiro quando administradas em quantidades adequadas(¹², ¹⁷).

A aplicação de BAL tem um efeito inibitório ou redutor em comunidades microbianas de bactérias Gram-positivas ou Gram-negativas. A competição entre bactérias patogênicas e BAL pela adesão aos sítios e pelos nutrientes reduzem a produção de biofilmes por patógenos(¹⁵, ¹⁸, ¹⁹). Desta forma, a aplicação de BAL como uma ferramenta de controle biológico é uma estratégia promissora para prevenir a contaminação das instalações de indústrias produtoras de alimentos por bactérias patogênicas.

Neste contexto, o objetivo deste estudo foi avaliar a habilidade de BAL em controlar biofilmes produzidos por S. Heidelberg em superfícies de poliestireno.

2. Materiais e Métodos

Bactérias ácido láticas

Um total de nove BAL foram selecionadas para este estudo: Lactobacillus salivaris (BAL1), Lactobacillus plantarum (BAL2), Lactobacillus curvatus (BAL3), Lactobacillus reuteri (BAL4), Lactobacillus paracasei (BAL5), Lactobacillus fermentum (BAL6), Lactobacillus bulgaricus (BAL7), Lactobacillus acidophilus (BAL8), Lactobacillus delbrueckii subesp. bulgaricus (BAL9). Cepas comerciais liofilizadas foram adquiridas de quatro laboratórios: Lemma Supply Solutions (São Paulo, Brasil) - BAL1, BAL2, BAL6 e BAL9; Pharma Nostra (Rio de Janeiro, Brasil) - BAL4, BAL7 e BAL8; Fagron (São Paulo, Brasil) - BAL5; e T.H.T. SA. (Gembloux, Bélgica) - BAL3.

As cepas foram reativas em caldo De Man, Rogosa & Sharpe (MRS - Merck; Darmstadt, Alemanha) a 37ºC por 24 h. Após, foi feito o plaqueamento em ágar MRS a 37ºC por 24 h. As cepas foram identificadas e selecionadas com base nas suas características bioquímicas e morfológicas(²⁰) e mantidas a -80ºC em caldo MRS suplementado com 30% (v/v) com glicerol estéril (Sigma-Aldrich; St. Louis, Estados Unidos).

Salmonella Heidelberg

Uma cepa de Salmonella Heidelberg (SH212), isolada de produto final de um abatedouro-frigorífico de frangos, foi gentilmente cedida pelo Instituto de Ciência e Tecnologia de Alimentos (ICTA) da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS) para este estudo. A cepa foi previamente sorotipificada pelo Instituto Osvaldo Cruz (Fiocruz, Rio de Janeiro, Brasil), e foi selecionada com base no seu perfil de multirresistência e na sua capacidade de formar biofilme(⁷). Além disto, esta cepa apresenta diversos genes associados à virulência(⁸). A cepa estava estocada a -20ºC em caldo cérebro-coração (BHI; Oxoid, Basigstoke, Reino Unido) suplementada com 20% (v/v) de glicerol. Para reativar a cepa, uma alíquota do estoque foi inoculada em caldo BHI e incubada a 37ºC por 24 h, sendo posteriormente plaqueada em ágar xilose lisina-deoxicolato (XLD - Merck; Darmstadt, Germany).

Preparação do inóculo

As cepas de BAL e de S. Heidelberg foram reativadas dos estoques e cultivadas overnight em caldo MRS e caldo triptona de soja sem glicose (TSB - Oxoid), respectivamente, a 37ºC por 24 h. Para o preparo do inóculo, a escala de McFarland No. 1 (Probac do Brasil; São Paulo, Brasil) foi utilizada como referência para ajustar a turbidez da suspensão bacteriana para uma concentração de 3 × 10⁸ CFU/mL.

Competição e inibição da adesão de Salmonella Heidelberg por bactérias ácido láticas

A técnica foi adaptada a partir da metodologia proposta por Gong & Jiang(²¹). Um total de onze tratamentos foram avaliados: avaliação individual de cada BAL (T1-T9) e dois pools de proporções iguais de cada uma das nove BAL (T10 e T11). Placas de poliestireno estéreis de 96 poços e fundo chato (Kasvi; São José dos Pinhais, Brasil) foram utilizadas para os ensaios de avaliação de competição e de inibição. Os experimentos foram repetidos duas vezes.

Para o teste de competição, 150 μL do inóculo de S. Heidelberg foram inoculados em cada poço. Alíquotas de 150 μL de cada BAL ou de cada pool foram inoculadas em cada poço. Cada tratamento foi repetido em nove poços. Para o controle positivo, foram utilizados 300 μL do inóculo de S. Heidelberg sem adição de BAL. Para o controle negativo, foram utilizados 300 μL de caldo MRS estéril. As microplacas foram incubadas a 37ºC por 48 h.

Para o teste de adesão, as microplacas foram pré-tratadas com 150 μL de cada BAL ou de cada pool por poço, com nove poços para cada tratamento. As microplacas foram incubadas a 37ºC por 48 h. Após a incubação, 150 μL do inóculo de S. Heidelberg foram inoculados em cada poço. As placas foram novamente incubadas a 37ºC por 24 h. Os controles positivos e negativos foram os mesmos do teste de competição.

Após a incubação, o conteúdo das microplacas foi removido e os poços foram lavados três vezes com 300 µL de solução salina estéril 0,9% (Synth; Diadema, Brasil). As bactérias aderidas foram fixadas com 300 µL de metanol (Neon; Suzano, Brazil) por poço por 15 min. Após, as placas foram esvaziadas e secas em temperatura ambiente. As placas foram então coradas com 300 µL por poço de cristal violeta de Hucker a 2% por 5 min. O corante foi removido e as placas foram gentilmente lavadas em água corrente. As placas foram secas com secador. Foi feita a ressuspensão do biofilme com 300 µL de ácido acético glacial 33% (Nuclear; Diadema, Brasil) por poço. A densidade óptica (DO) de cada poço foi medida em um leitor de absorbância Biochrom (Anthos 2010; Cambridge, Reino Unido) em um comprimento de onda de 550 nm. A DO de cada tratamento (DOT) foi obtida através da média aritmética dos respectivos poços. O ponto de corte (DOC) de cada microplaca testada foi definido como três desvios-padrão acima da DO média do controle negativo (MRS estéril). As cepas foram classificadas como produtoras (DOT ≤ DOC) ou não produtoras de biofilme (DOC > DOT)(²²).

Para avaliar o número de microrganismos viáveis, os procedimentos de formação de biofilme foram repetidos e, após a incubação, os poços das placas foram lavados duas vezes com água peptonada tamponada 0,1% (APT; Kasvi) e o fundo dos poços foi raspado com auxílio de uma alça de platina. A suspensão obtida foi homogeneizada por 30 s em vórtex. O conteúdo foi transferido para tubos estéreis e foram feitas diluições em APT 0,1%. A contagem bacteriana foi feita através do método drop plate(²³) em XLD e em ágar para contagem (PCA; Kasvi) para SH212 e BAL, respectivamente. As placas foram incubadas a 37ºC por 24 h e a contagem bacteriana foi expressa em unidades formadoras de colônia (UFC)/mL, posteriormente transformadas em log₁₀ UFC/mL.

Análises estatísticas

Os resultados obtidos foram analisados utilizando-se análise estatística descritiva e foram agrupados de acordo com a frequência relativa e absoluta. As contagens bacterianas foram analisadas utilizando o teste de análise de variância (ANOVA), seguido do teste post hoc de Tukey. A significância foi determinada em 5% e foi utilizado o programa PASW Statistics.

3. Resultados e discussão

Bactérias patogênicas e deteriorantes podem se aderir à maioria das superfícies encontradas nas plantas de produção de alimentos e muitas delas podem formar biofilmes. Estas estruturas aumentam a resistência bacteriana às condições ambientais adversas e aos compostos antimicrobianos(²⁴, ²⁵). S. Heidelberg, um sorovar emergente, é altamente persistente nas instalações de abatedouros-frigoríficos, e sua crescente resistência antimicrobiana é uma ameaça global(³, ¹⁰). Por estas razões, é importante encontrar métodos alternativos para remover ou prevenir os biofilmes bacterianos. Bactérias ácido láticas possuem a habilidade de formar biofilmes em superfícies que são utilizadas em plantas de processamento de alimentos, e o seu uso como uma alternativa natural aos desinfetantes tradicionais para o controle da colonização de microrganismos patogênicos tem sido estudado(²⁶, ²⁷).

Estudos in vitro realizados anteriormente demonstraram a ação bioprotetiva de BAL e bactérias probióticas em diversas superfícies contra diferentes patógenos(¹², ¹⁸, ¹⁹, ²⁶, ²⁸). Por esta razão, o uso de BAL como uma forma de controle dos biofilmes de S. Heidelberg em superfícies de poliestireno, muito utilizadas em ambientes de produção de alimentos, tem aumentado o interesse dos pesquisadores. As BAL mais comumente utilizadas incluem diferentes espécies de Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus, Enterococcus e Pediococcus(²⁵). Para este estudo, foram selecionadas espécies de Lactobacillus, um dos mais importantes gêneros de BAL. Lactobacillus são bactérias Gram-positivas, não formadoras de esporos e não são móveis(²⁹).

Os resultados da contagem bacteriana de SH212 nos ensaios de inibição e competição pela adesão de BAL estão descritos na Tabela 1.

Tabela 1
Contagem bacteriana de Salmonella Heidelberg (SH212) para os testes de inibição da adesão e competição utilizando-se bactérias ácido láticas (BAL), individualmente e em pools.

Tratamento	Contagem bacteriana (log10 UFC/mL) - média ± desvio-padrão
	Inibição	Competição
Controle positivo (SH212)	12,03 ± 0,18a	12,32 ± 0,24a
BAL1 + SH212	11,68 ± 0,62a	12,11 ± 0,28a
BAL2 + SH212	11,88 ± 0,24a	12,08 ± 0,18a
BAL3 + SH212	12,00 ± 0,24a	12,29 ± 0,35a
BAL4 + SH212	11,92 ± 0,30a	12,08 ± 0,25a
BAL5 + SH212	11,84 ± 0,28a	12,03 ± 0,56a
BAL6 + SH212	11,91 ± 0,24a	12,18 ± 0,33a
BAL7 + SH212	12,03 ± 0,11a	12,08 ± 0,35a
BAL8 + SH212	11,85 ± 0,50a	12,13 ± 0,44a
BAL9 + SH212	12,08 ± 0,45a	12,31 ± 0,24a
pool BALs 1	11,86 ± 0,47a	12,12 ± 0,22a
pool BALs 2	11,99 ± 0,35a	12,11 ± 0,28a

Legenda: Lactobacillus salivaris (BAL1), L. plantarum (BAL2), L. curvatus (BAL3), L. reuteri (BAL4), L. paracasei (BAL5), L. fermentum (BAL6), L. bulgaricus (BAL7), L. acidophilus (BAL8), L. delbrueckii subesp. bulgaricus (BAL9). Letras diferentes na mesma coluna indicam diferenças significiativas pelo teste de Tukey (p<0,05).

Gomaa et al.(³⁰) demonstraram que probióticos comerciais de Lactobacillus acidophilus e Lactobacillus paracasei inibiram a multiplicação de S. Heidelberg em testes in vitro. De acordo com os autores, a inibição do patógeno pode ser atribuída a diferentes fatores, incluindo a diminuição do pH, causada pela fermentação probiótica. Uma vez que valores baixos de pH (4,4-5,2) reduzem a multiplicação de S. Heidelberg(³¹), era esperado que a adição de BAL reduzisse a contagem de SH212. Entretanto, isto não foi observado neste estudo. Não foram observadas diferenças significativas (p>0,05) na contagem bacteriana entre o controle positivo e os tratamentos, independentemente do teste (inibição ou competição) e da BAL avaliada.

É possível que, mesmo que não tenham eliminado completamente S. Heidelberg, as BAL competissem com SH212 pelos sítios de adesão e prevenissem a formação de biofilme. Por esta razão, a capacidade antibiofilme das BAL também foi avaliada. Os resultados obtidos para a formação de biofilme por SH212 nos testes de inibição e adesão estão descritos na Tabela 2.

Tabela 2
Avaliação da formação de biofilme por Salmonella Heidelberg (SH212) nos testes de inibição e de competição.

Tratamento	Produção de biofilme: positiva (+) ou negativa (-)
	Inibição	Competição
Controle positivo (SH212)	+	+
BAL1 + SH212	+	+
BAL2 + SH212	-	-
BAL3 + SH212	-	-
BAL4 + SH212	-	-
BAL5 + SH212	-	-
BAL6 + SH212	-	-
BAL7 + SH212	-	-
BAL8 + SH212	-	-
BAL9 + SH212	-	-
pool BALs 1	-	-
pool BALs 2	-	-

Legenda: Lactobacillus salivaris (BAL1), L. plantarum (BAL2), L. curvatus (BAL3), L. reuteri (BAL4), L. paracasei (BAL5), L. fermentum (BAL6), L. bulgaricus (BAL7), L. acidophilus (BAL8), L. delbrueckii subesp. bulgaricus (BAL9).

O controle positive (SH212 sem tratamento) demonstrou a capacidade deste isolado em produzir biofilmes. Entre os onze tratamentos avaliados, a formação de biofilme só ocorreu no tratamento 1 (BAL1 - L. salivaris). Todos os outros tratamentos foram capazes de evitar a formação de biofilme em ambos os testes. Este efeito pode ser explicado devido à habilidade de BAL de se agregar com potenciais patógenos, bloqueando os seus sítios de adesão e produzindo substâncias antimicrobianas, como peróxido de hidrogênio e biosurfactantes que inibem a multiplicação e evitam a adesão destes patógenos(¹², ²⁶, ²⁸).

Estudos anteriores já demonstraram a atividade antibiofilme de BAL contra outros sorovares de Salmonella, incluindo S. Gallinarum, S. Typhimurium e S. Enteritidis(¹⁴, ¹⁵, ³², ³³). Entretanto, poucos estudos avaliaram S. Heidelberg, o que dificulta a comparação dos resultados e reforça a necessidades de novos estudos avaliando a ação de BAL contra este sorovar.

4. Conclusão

Os resultados encontrados demonstram que BAL são capazes de prevenir ou diminuir a formação de biofilme por S. Heidelberg em superfícies de poliestireno e podem ser utilizadas para estudos in vivo como potenciais alternativas para auxiliar no controle deste patógeno na indústria produtora de alimentos.

Agradecimentos

Os autores agradecem ao Dr. Eduardo Cesar Tondo e ao ICTA/UFRGS por gentilmente cederem a cepa de Salmonella Heidelberg.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  09 Set 2024
• Data do Fascículo
  2024

Histórico

• Recebido
  06 Jun 2023
• Aceito
  17 Abr 2024
• Publicado
  04 Jul 2024