Detecção da mutação da Brachyspina em vacas Holandês Uruguaias usando PCR em tempo real e análise da curva de fusão

Rodriguez, María Teresa Federici; Artigas, Rody; Guerra, Sofía; Sica, Andrea Branda; Vázquez, Noelia; Nicolini, Paula; Quintela, Fernando Dutra; Llambí, Silvia

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animal production • Cienc. Rural 51 (9) • 2021 • https://doi.org/10.1590/0103-8478cr20200872 copiar

Detecção da mutação da Brachyspina em vacas Holandês Uruguaias usando PCR em tempo real e análise da curva de fusão

Autoria SCIMAGO INSTITUTIONS RANKINGS

RESUMO:

A síndrome de Brachyspina (BS) é um defeito hereditário monogênico autossômico recessivo raro da raça Holstein Friesian causado por uma exclusão de 3,3 KB no gene FANCI localizado no cromossomo bovino 21, o que leva a um deslocamento de quadro e um códon de parada prematuro. Uma consequência da BS é a eficiência de reprodução reduzida e a produção de leite. O objetivo deste estudo foi o desenvolvimento de um método simples, rápido e sensível, baseado em PCR em tempo real e análise da curva de fusão para identificar animais portadores de BS. Sessenta e oito genótipos homozigotos normais e quatro heterozigotos foram detectados e confirmados através da análise tradicional de PCR e electophorese. Concluímos que o novo método é uma ferramenta confiável, altamente precisa e de baixo custo, que poderia ser usado para monitorar a presença da mutação BS na raça Holandês uruguaia.

Palavras-chave:
Bos taurus; Holandês; sindrome de Brachyspina; PCR em tempo real; análise da curva de fusão

Autoria

María Teresa Federici Rodriguez ^*E-mail: mfederici@inia.org.uy. *Corresponding author

Instituto Nacional de Investigación Agropecuaria (INIA), Canelones, Uruguay. Instituto Nacional de Investigación Agropecuaria (INIA)UruguayCanelones, UruguayInstituto Nacional de Investigación Agropecuaria (INIA), Canelones, Uruguay.

https://orcid.org/0000-0002-2795-4635

Rody Artigas

Facultad de Veterinaria, Universidad de la República (UDELAR), Montevideo, Uruguay.Universidad de la República (UDELAR),UruguayMontevideo, UruguayFacultad de Veterinaria, Universidad de la República (UDELAR), Montevideo, Uruguay.

https://orcid.org/0000-0002-9173-5752

Sofía Guerra

https://orcid.org/0000-0001-5391-8438

Andrea Branda Sica

https://orcid.org/0000-0002-4919-2563

Noelia Vázquez

https://orcid.org/0000-0002-5186-3768

Paula Nicolini

Instituto Superior de la Carne, Universidad de la República (UDELAR), Tacuarembó, Uruguay.Universidad de la República (UDELAR)UruguayTacuarembó, UruguayInstituto Superior de la Carne, Universidad de la República (UDELAR), Tacuarembó, Uruguay.

https://orcid.org/0000-0001-7678-6204

Fernando Dutra Quintela

División Laboratorios Veterinarios (DILAVE), Ministerio de Agricultura y Pesca (MGAP), Treinta y Tres, Uruguay.Ministerio de Agricultura y Pesca (MGAP)UruguayTreinta y Tres, UruguayDivisión Laboratorios Veterinarios (DILAVE), Ministerio de Agricultura y Pesca (MGAP), Treinta y Tres, Uruguay.

https://orcid.org/0000-0003-4886-9429

Silvia Llambí

https://orcid.org/0000-0003-2594-9338

E-mail: mfederici@inia.org.uy. ^*Corresponding author

DECLARATION OF CONFLICT OF INTERESTS

The authors declare no conflict of interest. The founding sponsors had no role in the design of the study; in the collection, analyses, or interpretation of data; in the writing of the manuscript, and in the decision to publish the results.

AUTHORS’ CONTRIBUTIONS

1. Study conception and design, 2. Data acquisition, 3. Data analysis, 4. Results discussion, 5. Writing of the manuscript, 6. Approval of the final version of the manuscript. M.T. Federici: 1, 2, 3, 4, 5, 6. R. Artigas: 1, 2, 3, 4, 5, 6. S. Guerra: 2, 3, 4, 6. A. Branda: 5, 6. N. Vazquez: 5, 6. P. Nicolini: 5, 6. F. Dutra: 6. S. Llambí:1, 6.

SCIMAGO INSTITUTIONS RANKINGS

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Figuras (3)
Tabelas (1)

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Figure 1
Standardization of primer concentration and annealing temperature of the duplex for the real time PCR for BS wild type and carrier mutation detection. Melting curves of the FANCI amplicons of BS carrier (heterozygous Aa) and “with” (homozygous AA) cows without IAC primers (A, B) and wild type IAC primers (C, D). A: 0.3 uM BS primers; 58 °C of annealing temperature; B: 0.3 uM BS primers, 55 °C of annealing temperature; C: 0.3 uM BS primers, 0.7 uM IAC primers, 55 °C annealing temperature; D: 0.3 uM BS and 0.2 uM IAC primers, 55 °C annealing temperature. x: Temperature (°C), deg.: degree y: dFluorescence/ dTemperature. d: derivative.

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Figure 2
Above: melting curves of FANCI and IAC gene amplicons in two control cows with heterozygous (Aa) and homozygous (AA) genotype, red and blue colored lines, and squares, respectively. x: Temperature (°C), y: dFluorescence/ dTemperature. d: derivative (standardized BS and IAC primer concentration of 0.3 uM and 55 °C of annealing temperature) Below: melting temperature of BS amplicon peak (peak 1) and IAC amplicon peak (peak 2) for each control sample.

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Figure 3
Gel electrophoresis of real time and end point PCR products of FANCI gene and endogenous control gene CD18^*, showing both heterozygous BS carrier and normal homozygous cows. Lanes 4,7 and 11: PCR amplicons of heterozygous carrier cows using real time PCR. Lanes: 1-3, 5, 6, 8-10: PCR amplicons of normal homozygous cows using real time PCR; Lane 12: PCR amplicon of heterozygous carrier cow using end point PCR; Lane 13: PCR amplicon of normal homozygous cow using end point PCR. Lane 14: negative control (no DNA) using real time PCR. Lane 15: molecular weight marker of 10000 bp.

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Table 1
PCR primers, (BS, IAC): F: forward, R: reverse sequence, melting temperature (Tm) and amplification product size in base pairs (bp.)

Figure 1 Standardization of primer concentration and annealing temperature of the duplex for the real time PCR for BS wild type and carrier mutation detection. Melting curves of the FANCI amplicons of BS carrier (heterozygous Aa) and “with” (homozygous AA) cows without IAC primers (A, B) and wild type IAC primers (C, D). A: 0.3 uM BS primers; 58 °C of annealing temperature; B: 0.3 uM BS primers, 55 °C of annealing temperature; C: 0.3 uM BS primers, 0.7 uM IAC primers, 55 °C annealing temperature; D: 0.3 uM BS and 0.2 uM IAC primers, 55 °C annealing temperature. x: Temperature (°C), deg.: degree y: dFluorescence/ dTemperature. d: derivative.

Figure 2 Above: melting curves of FANCI and IAC gene amplicons in two control cows with heterozygous (Aa) and homozygous (AA) genotype, red and blue colored lines, and squares, respectively. x: Temperature (°C), y: dFluorescence/ dTemperature. d: derivative (standardized BS and IAC primer concentration of 0.3 uM and 55 °C of annealing temperature) Below: melting temperature of BS amplicon peak (peak 1) and IAC amplicon peak (peak 2) for each control sample.

Figure 3 Gel electrophoresis of real time and end point PCR products of FANCI gene and endogenous control gene CD18^*, showing both heterozygous BS carrier and normal homozygous cows. Lanes 4,7 and 11: PCR amplicons of heterozygous carrier cows using real time PCR. Lanes: 1-3, 5, 6, 8-10: PCR amplicons of normal homozygous cows using real time PCR; Lane 12: PCR amplicon of heterozygous carrier cow using end point PCR; Lane 13: PCR amplicon of normal homozygous cow using end point PCR. Lane 14: negative control (no DNA) using real time PCR. Lane 15: molecular weight marker of 10000 bp.

Table 1 PCR primers, (BS, IAC): F: forward, R: reverse sequence, melting temperature (Tm) and amplification product size in base pairs (bp.)

Primer	Primer sequence 5´- 3´	Primer (Tm)	Product sizes (pb)
BY- F	5´GCTCAAGTAGTTAGTTGCTCCACTG 3´	58	3.3kb/409 bp
BY- R	5´ATAAATAAATAAAGCAGGATGCTGCTGAAA 3´	55	3.3kb/409bp
IAC- F	5´AGGCAGTTGCGTTCAACGTG 3´	54	159pb
IAC-2	5´CCGACTCGGTGATGCCATTGA 3´	56	159pb

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