Resumos
A piroplasmose equina causada por Theileria equi acomete os equinos de forma endêmica no Brasil e em diversos outros países tropicais e subtropicais. Considerada uma das mais importantes doenças de equinos, causa danos à saúde animal e perdas econômicas. A proteína equi merozoite antigen (EMA-2) é uma das principais proteínas de superfície, expressa nos diversos estágios do ciclo do parasita, estimula resposta imune em animais infectados, tornando-se um possível candidato para utilização em diagnóstico. O gene EMA-2 foi clonado e expresso na levedura Pichia pastoris. A proteína EMA-2 recombinante (rEMA-2) foi caracterizada antigenicamente por Western Blot e por ELISA indireto, utilizando-se soro de equino positivo para theileriose. O resultado do ELISA demonstrou uma especificidade de 90,9% e sensibilidade de 83,3%, quando comparado ao padrão, sendo superior à imunofluorescência (80,6% de especificidade e 75,0% de sensibilidade), o que sugere que a rEMA-2 expressa em P. pastoris é um promissor antígeno para ser utilizado como ferramenta no imunodiagnóstico de theileriose equina
equinos; imunodiagnóstico; piroplasmose; theileriose
Theileria equi, the causative agent of equine piroplasmosis, is endemic in Brazil and many other tropical and subtropical countries. It is considered one of the most important diseases of horses causing animal health problems and significant economic loss. The Protein equi merozoite antigen-2 (EMA-2) is a major surface protein that is expressed in different parasite cycle stages and induces immune response in infected animals, being a possible candidate to be used in diagnose. EMA-2 gene was cloned and expressed in the yeast Pichia pastoris, and the recombinant protein EMA-2 (rEMA-2) was characterized by Western Blot and indirect ELISA using equine positive sera. The ELISA results demonstrated a specificity of 90.9% and a sensitivity of 83.3% compared to the standard ELISA and being superior to immunofluorescence (80.6% of specificity and 75.0% of sensitivity) suggesting that the rEMA-2 expressed in P. pastoris is a promising antigen to be used as a tool in immunodiagnostic of theileriasis
equines; immunodiagnostic; piroplasmosis; theileriasis
INTRODUÇÃO:
Theileria equi, anteriormente denominado Babesia equi (MEHLHORN & SCHEIN, 1998MEHLHORN, H.; SCHEIN, E. Redescription of Babesia equi Laveran, 1901 as
Theileria equi Mehlhorn, Schein 1998. Parasitology Research, v.84, p.467-475, 1998.
Disponível em: <http://link.springer.com/article/10.1007/s004360050431#page-1>.
Acesso em: 20 maio 2013. doi: 10.1007/s004360050431.
http://link.springer.com/article/10.1007...
), é um protozoário
hemoparasita e agente etiológico de piroplasmose equina (MEALEY et al., 2012MEALEY, R.H. et al. Protective effects of passively transferred
merozoite-specific antibodies against Theileria equi in horses with severe combined
immunodeficiency. Clinical and Vaccine Immunology, v.19, n.1, p.100-104, 2012.
Disponível em: <www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22038847>. Acesso em: 20 maio 2013.
doi: 10.1128/CVI.05301-11.
www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22038847...
). No Brasil, apresenta-se de forma endêmica, levando a
significativas perdas econômicas (BALDANI et al.,
2011BALDANI, C.D. et al. Production of recombinant EMA-1 protein and its
application for the diagnosis of Theileria equi using an enzyme immunoassay in horses
from São Paulo State, Brazil. Revista Brasileira Parasitologia Veterinária, v.20,
n.1, p.54-60, 2011. Disponível em: <www.scielo.br/pdf/rbpv/v20n1/a11v20n1>.
Acesso em: 03 jun. 2013. doi: 10.1590/S1984-29612011000100011.
www.scielo.br/pdf/rbpv/v20n1/a11v20n1...
).
A transmissão de T. equi ocorre no repasto do carrapato, inoculando suas
formas infectantes (esporozoítos). Uma vez no hospedeiro, os esporozoítos infectam os
leucócitos (MEHLHORN & SCHEIN, 1998MEHLHORN, H.; SCHEIN, E. Redescription of Babesia equi Laveran, 1901 as
Theileria equi Mehlhorn, Schein 1998. Parasitology Research, v.84, p.467-475, 1998.
Disponível em: <http://link.springer.com/article/10.1007/s004360050431#page-1>.
Acesso em: 20 maio 2013. doi: 10.1007/s004360050431.
http://link.springer.com/article/10.1007...
) e
posteriormente os eritrócitos (UILENBERG, 2006UILENBERG, G. Babesia - A historical overview. Veterinary Parasitology,
v.138, p.3-10, 2006. Disponível em: <www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16513280>.
Acesso em: 20 out. 2012. doi: 10.1016/j.vetpar.2006.01.035.
www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16513280...
).
A transmissão congênita de T. equi também pode ocorrer levando ao aborto ou
morte peri natal (HEIM et al., 2007HEIM, A. et al. Detection and molecular characterization of Babesia
caballi and Theileria equi isolates from endemic areas of Brazil. Parasitology
Research, v.102, p.63-68, 2007. Disponível em:
<www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17828553>. Acesso em: 03 jun. 2013. doi:
10.1007/s00436-007-0726.
www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17828553...
). Os sinais
clínicos variam de quadros assintomáticos a agudos (febre, icterícia e anemia). Animais
que se recuperam de infecções agudas deixam de apresentar os sintomas e permanecem como
reservatórios de T. equi, mantendo a doença endêmica (HEIM et al., 2007HEIM, A. et al. Detection and molecular characterization of Babesia
caballi and Theileria equi isolates from endemic areas of Brazil. Parasitology
Research, v.102, p.63-68, 2007. Disponível em:
<www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17828553>. Acesso em: 03 jun. 2013. doi:
10.1007/s00436-007-0726.
www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17828553...
). Devido à grande disseminação de ambos, T.
equi e os diversos carrapatos vetores, o diagnóstico e prevenção desta
enfermidade se fazem necessários tanto em áreas endêmicas como em não endêmicas (HUANG et al., 2003HUANG, X. et al. High-Level expression and purification of a truncated
Merozoite Antigen-2 of Babesia equi in Escherichia coli and its potential for
immunodiagnosis. Journal of Clinical Microbiology, v.41, p.1147-1151, 2003.
Disponível em: <www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12624044>. Acesso em: 03 jun. 2013.
doi: 10.1128/JCM.41.3.1147-1151.
www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12624044...
).
Theileriose tem sido diagnosticada por diversos métodos, tais como: Esfregaços
sanguíneos corados por Giemsa, Teste de Fixação do Complemento (TFC), Teste de
Imunofluorescência Indireta (IFAT), Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), Ensaio
imunoenzimático (ELISA), utilizando lisados do parasito (HUANG et al., 2006HUANG, X. et al. Evaluation of enzyme-linked immunosorbent assays with
recombinant antigens for the serodiagnosis of equine Babesia infections. Veterinary
Parasitology, Short communication, 2006. Disponível em:
<www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16621293>. Acesso em: 03 jun. 2013. doi:
10.1016/j.vetpar.2006.03.013.
www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16621293...
), e ELISAs comerciais, utilizando proteínas recombinantes
(KNOWLES et al., 1992KNOWLES, D.P. et al. Antibody to a recombinant merozoite protein epitope
identifies horses infected with Babesia equi. Journal of Clinical Microbiology, v.30,
p.3122-3126, 1992. Disponível em: <http://jcm.asm.org/content/30/12/3122>.
Acesso em: 31 jan. 2013.
http://jcm.asm.org/content/30/12/3122...
). Entretanto, alguns
destes métodos possuem suas limitações, incluindo baixa sensibilidade descrita para TFC,
problema de subjetividade e baixa sensibilidade para o IFAT e preparações complicadas e
laboriosas na utilização de antígenos lisados do parasito no ELISA (HUANG et al., 2006HUANG, X. et al. Evaluation of enzyme-linked immunosorbent assays with
recombinant antigens for the serodiagnosis of equine Babesia infections. Veterinary
Parasitology, Short communication, 2006. Disponível em:
<www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16621293>. Acesso em: 03 jun. 2013. doi:
10.1016/j.vetpar.2006.03.013.
www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16621293...
).
Segundo a OIE (2010)OFFICE INTERNATIONAL DES EPIZOOTIES (OIE). Pruebas de diagnóstico
prescritas y de sustitución para las enfermedades de la lista de la OIE, 2010.
Disponível em:
<http://www.oie.int/fileadmin/Home/esp/Health_standards/tahc/2010/es_chapitre_1.1.3.htm>.Acesso
em: 23 out. 2012.
http://www.oie.int/fileadmin/Home/esp/He...
, os métodos prescritos para
que se obtenha a permissão para o transporte internacional de equinos são ELISA e o
IFAT, sendo o TFC um substituto, portanto os testes sorológicos exercem um papel
importante no trânsito desses animais. O IFAT, no entanto, necessita de profissionais
experientes para sua realização e detecção da theileriose equina (RAMPERSAD et al., 2003RAMPERSAD, J. et al. A field evaluation of PCR for the routine detection
of Babesia equi in horses. Veterinary Parasitology, v.114, p.81-87, 2003. Disponível
em: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12781470>. Acesso em: 03 maio 2013.
doi: 10.1016/S0304-4017(03)00129-8.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12781...
). ELISAs tem sido realizados utilizando
diferentes antígenos recombinantes, o que demonstra que pode ser um teste útil para
identificação de theileriose em equinos (BALDANI et al.,
2011BALDANI, C.D. et al. Production of recombinant EMA-1 protein and its
application for the diagnosis of Theileria equi using an enzyme immunoassay in horses
from São Paulo State, Brazil. Revista Brasileira Parasitologia Veterinária, v.20,
n.1, p.54-60, 2011. Disponível em: <www.scielo.br/pdf/rbpv/v20n1/a11v20n1>.
Acesso em: 03 jun. 2013. doi: 10.1590/S1984-29612011000100011.
www.scielo.br/pdf/rbpv/v20n1/a11v20n1...
).
Os antígenos de superfície (EMAs- equi merozoite antigen) exercem
importante papel na aderência e penetração de T. equi nos eritrócitos dos
hospedeiros (NIZOLI et al., 2009NIZOLI, L. Q. et al. Immunogenicity and antigenicity of the recombinant
EMA-1 protein of Theileria equi expressed in the yeast Pichia pastoris. Brazil.
Journal, Veterinary Parasitology v.18, n.2, p.1-4, 2009. Disponível em:
<http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S1984-296120090
00200001&script=sci_arttext.>. Acesso em: 15 abr. 2013.
doi:10.4322/rbpv.01802001.
http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S198...
). São expressos
durante os vários estágios do ciclo, tanto no hospedeiro definitivo como no vetor (UETI et al., 2003UETI, M.W. et al. Expression of Equi merozoite Antigen 2 during
development of Babesia equi in the midgut and salivary gland of the vector tick
Boophilus microplus. Journal of Clinical Microbiology, v.41, p.5803-5809, 2003.
Disponível em: <www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14662988>. Acesso em: 3 maio 2013.
doi: 10.1128/JMC.41.12.5803-5809.2003.
www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14662988...
), tornando-se excelentes alvos na
detecção de anticorpos contra este parasita.
Dentre as estratégias utilizadas para a produção de antígenos, utiliza-se a levedura
Pichia pastoris, que concilia vantagens na manipulação genética,
associada ao crescimento em meios de cultivo simples. Por ser um organismo eucarioto,
P. pastoris proporciona a expressão de proteínas com modificações
pós-traducionais, como glicosilação, além de secretar as proteínas heterólogas de forma
solúvel no meio, simplificando etapas de purificação (CEREGHINO & CREGG, 2000CEREGHINO, J.L.; CREGG, J.M. Heterologous protein expression in the
methylotrophic yeast Pichia pastoris. FEMS Microbiology Reviews, v.24, n.1, p.45-66,
2000. Disponível em: <www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10640598>. Acesso em: 20 maio
2013. doi: 10.1111/j.1574-6976.2000.tb00532.x.
www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10640598...
). O presente trabalho teve por objetivo
avaliar a proteína EMA-2 recombinante (rEMA-2), expressa em P. pastoris, e
sua utilização como antígeno em ELISA indireto.
METODOLOGIA:
Linhagens, cultivo e extração de DNA
O DNA de T. equi foi extraído conforme o método de MILLER et al. (1988)MILLER, S.A. et al. A simples salting out procedure for extracting DNA
from human nucleated cells. Nucleic Acids Research, v.6, p.1215, 1988. Disponível em:
<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC334765/>. Acesso em: 3 maio 2013.
doi: 10.1093/nar/16.3.1215.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles...
modificado, utilizando sangue de um equino
infectado experimentalmente (cepa UFPel E15) e comprovado por IFAT pelo Laboratório de
Doenças Parasitárias da Universidade Federal de Pelotas (UFPel) (NIZOLI et al., 2009NIZOLI, L. Q. et al. Immunogenicity and antigenicity of the recombinant
EMA-1 protein of Theileria equi expressed in the yeast Pichia pastoris. Brazil.
Journal, Veterinary Parasitology v.18, n.2, p.1-4, 2009. Disponível em:
<http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S1984-296120090
00200001&script=sci_arttext.>. Acesso em: 15 abr. 2013.
doi:10.4322/rbpv.01802001.
http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S198...
).
Amplificação e sequenciamento do gene que codifica EMA-2
A sequência do gene que codifica para a proteína EMA-2 foi amplificada por PCR como descrito: o total do PCR-Mix foi de 25µL, contendo 0,5µL de Taq DNA polimerase (5U/µL), 2,0µL 10x PCR tampão, 1,5µL 50mM MgCl2, 0,5µL dNTPs, 0,5µL 10pmol µL-1 oligoiniciadores anterógrado (5' - CAC CGC GGG GAA TGT TGA GCA A - 3') e oligoiniciadores retrógrado (5' - CCT CTA GAC GGT AGA ACA AAG CAA CGG CG - 3'), 1µL de DNA (~120ng), obtido como descrito e água estéril para completar o volume da reação. Os oligoiniciadores para EMA-2 foram desenhados utilizando-se o programa Vector NTI a partir das sequências depositadas no GenBank, acesso AB013725. O produto de PCR foi purificado usando-se o kit Real Genomics da Bio America - Hiyield(tm) Gel/PCR DNA Minikit. O sequenciamento do gene foi realizado por ACTGene Análises Moleculares Ltda (Centro de Biotecnologia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS), utilizando o sequenciador automático ABI-PRISM 3100.
Clonagem do gene EMA-2
Foi feita a digestão do vetor pPICZαB e do gene EMA-2 com as enzimas SacII (Biolabs 20.000U mL-1) e XBaI (Invitrogen 20.000U mL-1). Para a ligação do gene EMA-2 com o vetor pPICZαB, procedeu-se segundo o protocolo EasySelect(tm) Pichia Expression Kit-Catalog K1740-01 (Invitrogen). O vetor pPICZαB possui sítio para a adição de cauda de seis histidinas (6xHis) na porção carboxi-terminal da proteína (Invitrogen).
Seleção das colônias recombinantes e Expressão da proteína rEMA-2 em P. pastoris
Foram preparados os pré-inóculos das colônias transformadas seguindo o protocolo da EasySelect Pichia Expression Kit (Invitrogen) para colônias Mut+ com algumas modificações. Usou-se um volume de meio BMGY de 50mL e após passou-se para 90mL do meio BMMY. As amostras foram induzidas com 450μL de metanol filtrado para a produção da proteína por 120h. Ao final da indução, as amostras foram centrifugadas a 10.000 x g por 10min, o precipitado foi desprezado e o sobrenadante armazenado. No sobrenadante do cultivo, foi adicionado sulfato de amônio suficiente para atingir 80% de saturação. O sulfato de amônio foi adicionado ao sobrenadante sob agitação a 4°С e mantido por 18h. Após este período, foi novamente centrifugado a 6.000 x g 15min-1 4°С e o precipitado suspendido com 2mL de água destilada.
Purificação e quantificação da proteína
A purificação da proteína recombinante foi realizada por diálise. Utilizou-se uma membrana semipermeável com ponto de corte 12KDa (Viskase corporation Dry 21mm). A membrana foi acondicionada em frasco contendo 1L de água destilada e mantido a 4°С sob agitação durante 48h, sendo que, nas primeiras 12h, a água foi trocada a cada 2h. Após este período, o material dialisado foi mantido a -70°С para posterior liofilização (Liofilizador L101 - Liptop, Liobras).
Para a quantificação da proteína, seguiu-se o protocolo proposto por BRADFORD (1976)BRADFORD, M. Analytical biochemistry. v.72, p.248-254, 1976. Disponível
em:
<http://www.ciens.ucv.ve:8080/generador/sites/lab-bioq-gen/archivos/Bradford%201976.pdf>.
Acesso em: 10 out. 2013.
http://www.ciens.ucv.ve:8080/generador/s...
. Uma amostra de 10mg da proteína
liofilizada foi diluída em 1mL de água destilada. O método foi padronizado usando-se
uma curva de diluição de Albumina Sérica Bovina 10% (BSA). A leitura das amostras foi
feita em espectrofotômetro TP-READER - Thermo Plate
Western Blot
Realizou-se um Western Blot segundo SAMBROOK & RUSSEL (2001)SAMBROOK, J.; RUSSEL, D.W. Molecular cloning. A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 2001. p.9.16-9.17.. Após eletroforese no gel de poliacrilamida 12% (SDS-PAGE), a proteína foi transferida para membrana de nitrocelulose (Amershan(tm) Hybond(tm)- ECL GE Healthcare). Foi utilizado o marcador de proteínas BenchMark(tm) Prestained Protein Ladder 250µL (Invitrogen); 20µL da proteína EMA-2, BSA 10% (controle negativo). Após bloqueio, a membrana foi incubada com Anti-His C-terminal-HRP AB (Invitrogen), diluída 1:5000 (v/v) em PBS-T. Foi realizado um Western blot, segundo SAMBROOK & RUSSEL (2001)SAMBROOK, J.; RUSSEL, D.W. Molecular cloning. A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 2001. p.9.16-9.17., com soro equino positivo para theileriose (IFAT) na concentração de 1:100 (v/v em salina isotônica com tampão fosfato contendo Tween-20 PBS-T) e, como anticorpo secundário, utilizou-se soro anti-equino conjugado com peroxidase (Sigma) 1:3000. O marcador utilizado foi Precision Plus Protein Dual Color Standards (Bio Rad).
ELISA
Utilizou-se quarenta e um soros equinos de diferentes origens, porém todos pacientes do hospital da UFPel e testados por IFAT (4 positivos e 37 negativos por IFAT), um soro controle positivo de equino infectado experimentalmente e um soro controle negativo para T. equi, retirado de um potro pertencente a rebanho sem histórico para theileriose e testado por PCR, imunofluorescência e ELISA padrão.
O antígeno rEMA-2 foi aplicado às placas de Poliestireno (Nunc(tm)-Placa imuno Polysorp - 96 orifícios) na concentração de 200ng mL-1, diluído em tampão carbonato bicarbonato pH 9.6, por 18 horas a 4oC. Após três lavagens, bloqueou-se com leite em pó a 5% em PBS-T. Posteriormente, os controles positivos, negativos e os soros a serem testados foram diluídos em PBS-T na concentração de 1:100 e adicionados em duplicata à placa. Incubou-se a 37°С por 90min e, após três lavagens, adicionou-se o anti-IgG equino conjugado com peroxidase (Sigma), diluído 1:6000; a placa foi incubada a 37°С durante 90min. Após lavagem, o cromógeno/substrato tampão citrato/fosfato (TPS) foi adicionado e a placa mantida 15min no escuro. A reação foi interrompida pela adição de 50µL orifício-1 de H2SO4 1N. As absorbâncias foram medidas no leitor de micro placas (TP-READER - Thermo Plate), utilizando 492nm de comprimento de onda. Os mesmos soros equinos testados por ELISA com a proteína recombinante e por IFAT foram testados também com kit de ELISA padrão-ELISA competitivo (VMRD. Inc. Babesia equi Antibody Test Kit, cELISA).
Análise estatística
A análise ROC (Receiver Operating Characteristic) foi realizada pelo software estatístico MedCalc, versão 10.3.0.0, www.medcalc.be.
RESULTADOS E DISCUSSÃO:
ELISAs têm sido utilizados no diagnóstico de T. equi com a utilização de
diferentes antígenos recombinantes, tais como: EMA-1 (KNOWLES et al., 1992KNOWLES, D.P. et al. Antibody to a recombinant merozoite protein epitope
identifies horses infected with Babesia equi. Journal of Clinical Microbiology, v.30,
p.3122-3126, 1992. Disponível em: <http://jcm.asm.org/content/30/12/3122>.
Acesso em: 31 jan. 2013.
http://jcm.asm.org/content/30/12/3122...
; BALDANI et al.,
2011BALDANI, C.D. et al. Production of recombinant EMA-1 protein and its
application for the diagnosis of Theileria equi using an enzyme immunoassay in horses
from São Paulo State, Brazil. Revista Brasileira Parasitologia Veterinária, v.20,
n.1, p.54-60, 2011. Disponível em: <www.scielo.br/pdf/rbpv/v20n1/a11v20n1>.
Acesso em: 03 jun. 2013. doi: 10.1590/S1984-29612011000100011.
www.scielo.br/pdf/rbpv/v20n1/a11v20n1...
), EMA-2 (TANAKA et al., 1999TANAKA, T. et al. Expression of Babesia equi merozoite antigen-2 by
recombinant baculovirus and its use in the ELISA. International journal for
Parasitology, v.29, p.1803-1808, 1999. Disponível em:
<www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10616926>. Acesso em: 15 abr. 2013.
doi:10.1016/S0020-7519(99)00146-0.
www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10616926...
;
KUMAR et al., 2013KUMAR, S. et al. Development of EMA-2 recombinant antigen based
enzyme-linked immunosorbent assay for seroprevalence studies of Theileria equi
infection in Indian equine population. Veterinary Parasitology, v.198, p.10-17, 2013.
Disponível em: <www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0304401713004949>.
Acesso em: 01 fev. 2014. doi: 10.1016/j.vetpar.2013.08.030.
www.sciencedirect.com/science/article/pi...
), Be82 (HIRATA et al., 2002HIRATA, H. et al. Cloning of a truncated Babesia equi gene encoding an
82-kilodalton protein and its potential use in an enzyme-linked immunosorbent assay.
Journal of Clinical Microbiology, v.40, p.1470-1474, 2002. Disponível em:
<www.ncbi.nlm.nih.gov>. Acesso em: 03 fev. 2014. doi:
10.1128/JCM.40.4.1470-1474.2002.
www.ncbi.nlm.nih.gov...
) e Be158 (HIRATA et al., 2005HIRATA, H. et al. Cloning of a novel Babesia equi gene encoding a
158-kilodalton protein useful for serological diagnosis. Clinical and Vaccine
Immunology, v.12, n.2, p.334-338, 2005. Disponível em:
<http://cvi.asm.org/content/12/2/334.short>. Acesso em: 03 fev. 2014. doi:
10.1128/CDLI.12.2.334-338.2005.
http://cvi.asm.org/content/12/2/334.shor...
), expressos em E. coli e
baculovírus, o que demonstra que estas proteínas recombinantes podem ser um teste útil
para identificação de theileriose em equinos (OIE, 2008). Estudos anteriores mostraram
que tanto a proteína EMA-1 quanto EMA-2 são expressas em diferentes estágios do ciclo do
parasita extra e intra eritrocitário (KUMAR et al.,
2004KUMAR, S. et al. Expression of Babesia equi EMA-1 and EMA-2 during
merozoite developmental stages in erythrocyte and their interaction with erythrocytic
membrane skeleton. Molecular and Biochemical Parasitology, v.133, p.221-227, 2004.
Disponível em: <www.ncbi.nim.nih.gov/pubmed/14698434>. Acesso em: 08 out. 2013.
doi: 10.1016/j.molbiopara.2003.10.010.
www.ncbi.nim.nih.gov/pubmed/14698434...
). Entretanto, EMA-2 é liberada no citoplasma e na membrana deste
eritrócito, sugerindo ser um dos primeiros antígenos a serem reconhecidos pelo sistema
imune (KUMAR et al., 2004, 2013KUMAR, S. et al. Expression of Babesia equi EMA-1 and EMA-2 during
merozoite developmental stages in erythrocyte and their interaction with erythrocytic
membrane skeleton. Molecular and Biochemical Parasitology, v.133, p.221-227, 2004.
Disponível em: <www.ncbi.nim.nih.gov/pubmed/14698434>. Acesso em: 08 out. 2013.
doi: 10.1016/j.molbiopara.2003.10.010.
www.ncbi.nim.nih.gov/pubmed/14698434...
). Recentemente,
BHOORA et al. (2010)BHOORA, R. et al. Sequence heterogeneity i the equi merozoite antigen
gene (ema-1) of Theileria equi and development of na ema-1-specific Taq-Man MGB assay
for the detection of T. equi. Veterinary Parasitology, v.172, n.1-2, p.33-45, 2010.
Disponível em: <www.ncbi.nln.nih.gov/pubmed/?term=EMA-1+ and+Bhoora>. Acesso
em: 04 fev. 2014. doi: 10.1016/j.vetpar.2010.04.025.
www.ncbi.nln.nih.gov/pubmed/?term=EMA-1+...
, MUNKHJARGAL et al. (2013)MUNKHJARGAL, T. et al. Prevalence and genetic diversity of equine
piroplasms in Tov province, Mongolia. Infection Genetic Evolution, v.16, p.178-185,
2013. Disponível em: <www.ncbi.nln.nih.gov/pubmed/23416256>. Acesso em: 04 fev.
2014. doi: 10.1016/j.meegid.2013.02.005.
www.ncbi.nln.nih.gov/pubmed/23416256...
, KUMAR et
al. (2013)KUMAR, S. et al. Development of EMA-2 recombinant antigen based
enzyme-linked immunosorbent assay for seroprevalence studies of Theileria equi
infection in Indian equine population. Veterinary Parasitology, v.198, p.10-17, 2013.
Disponível em: <www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0304401713004949>.
Acesso em: 01 fev. 2014. doi: 10.1016/j.vetpar.2013.08.030.
www.sciencedirect.com/science/article/pi...
relataram diversidade genética em amostras baseadas no gene da
EMA-1, o que poderia alterar a especificidade e sensibilidade de um teste de diagnóstico
no qual o antígeno escolhido fosse a EMA-1. Esta diversidade genética ainda não foi
reportada em relação à EMA-2. Estas observações nos levaram à escolha da proteína
recombinante EMA-2 para o desenvolvimento de nossos estudos. Nossos resultados
corroboram os de KUMAR et al. (2013)KUMAR, S. et al. Development of EMA-2 recombinant antigen based
enzyme-linked immunosorbent assay for seroprevalence studies of Theileria equi
infection in Indian equine population. Veterinary Parasitology, v.198, p.10-17, 2013.
Disponível em: <www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0304401713004949>.
Acesso em: 01 fev. 2014. doi: 10.1016/j.vetpar.2013.08.030.
www.sciencedirect.com/science/article/pi...
, que,
utilizando ELISA com antígeno de EMA-2, apresentaram uma correlação com o ELISA
padrão.
Neste trabalho, a proteína EMA-2 foi expressa em P. pastoris e apresentou epítopos (sequenciais e/ou conformacionais) que foram reconhecidos por anticorpos presentes nos soros de equinos naturalmente infectados. O sequenciamento do gene mostrou 99% de homologia com a sequência depositada no GenBank AB013725.
Segundo CEREGHINO & CREGG (2000)CEREGHINO, J.L.; CREGG, J.M. Heterologous protein expression in the
methylotrophic yeast Pichia pastoris. FEMS Microbiology Reviews, v.24, n.1, p.45-66,
2000. Disponível em: <www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10640598>. Acesso em: 20 maio
2013. doi: 10.1111/j.1574-6976.2000.tb00532.x.
www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10640598...
, outras
proteínas de superfície de protozoários também foram expressas em P.
pastoris como Plasmodium falciparum merozoite surface protein
1 (MSP-1) e Plasmodium vivax apical membrane antigen 1 (AMA-1). O sistema
de expressão P. pastoris que foi utilizado para a expressão da proteína
EMA-2 de T. equi, proporciona um aumento na produção da proteína, se
comparada ao sistema E. coli, pois as proteínas são secretadas para o meio
facilitando sua purificação (HARTWIG et al.,
2010HARTWIG, D.D. et al. High yield expression of leptospirosis vaccine
candidates LigA and Lig32 in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. Microbial Cell
Factories, v.9, p.98, 2010. Disponível em:
<http://www.microbialcellfactories.com/cont ent/ 9/1/98>. Acesso em: 04 fev.
2014. doi: 10.1186/1475-2859-9-98.
http://www.microbialcellfactories.com/co...
).
Western Blot, utilizando anticorpo anti-histidina (Figura 1A) e soro de equino naturalmente infectado, (Figura 1B) reconheceram a proteína rEMA-2. A proteína
foi avaliada por ELISA com soros de equinos controles (positivo e negativo por IFAT), e
foi reconhecida por soros de equinos naturalmente infectados, demonstrando a sua
antigenicidade. O kit de ELISA comercial (VMRD. Inc. Babesia
equi Antibody Test Kit, cELISA) foi utilizado como padrão para avaliar os
resultados com um teste semelhante (KUMAR et al.,
2013KUMAR, S. et al. Development of EMA-2 recombinant antigen based
enzyme-linked immunosorbent assay for seroprevalence studies of Theileria equi
infection in Indian equine population. Veterinary Parasitology, v.198, p.10-17, 2013.
Disponível em: <www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0304401713004949>.
Acesso em: 01 fev. 2014. doi: 10.1016/j.vetpar.2013.08.030.
www.sciencedirect.com/science/article/pi...
). Usando-se a média da leitura de densidade ótica de ELISA e o ponto de
corte estabelecido por análise ROC, os resultados sugerem a possibilidade de diferenciar
animais positivos e negativos para theileriose. Na análise ROC, os pontos de corte
basearam-se nos resultados do ELISA padrão. Quando se comparou ELISA teste (placa
sensibilizada com a proteína rEMA-2) com ELISA padrão, obteve-se uma especificidade de
90,9% e sensibilidade de 83,3% (Figura 2A). KUMAR et al. (2013)KUMAR, S. et al. Development of EMA-2 recombinant antigen based
enzyme-linked immunosorbent assay for seroprevalence studies of Theileria equi
infection in Indian equine population. Veterinary Parasitology, v.198, p.10-17, 2013.
Disponível em: <www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0304401713004949>.
Acesso em: 01 fev. 2014. doi: 10.1016/j.vetpar.2013.08.030.
www.sciencedirect.com/science/article/pi...
obtiveram 97,0% de sensibilidade
e 96,0% de especificidade ao compararem ELISA desenvolvido com o mesmo teste padrão
usado neste trabalho. No presente trabalho, além de um número menor de animais, usou-se
o teste estatístico ROC, enquanto KUMAR et al.
(2013)KUMAR, S. et al. Development of EMA-2 recombinant antigen based
enzyme-linked immunosorbent assay for seroprevalence studies of Theileria equi
infection in Indian equine population. Veterinary Parasitology, v.198, p.10-17, 2013.
Disponível em: <www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0304401713004949>.
Acesso em: 01 fev. 2014. doi: 10.1016/j.vetpar.2013.08.030.
www.sciencedirect.com/science/article/pi...
analisaram utilizando desvio padrão o que tende a diminuir a acurácia
na obtenção dos resultados. Ao se comparar os resultados da presente pesquisa com os de
TANAKA et al. (1999)TANAKA, T. et al. Expression of Babesia equi merozoite antigen-2 by
recombinant baculovirus and its use in the ELISA. International journal for
Parasitology, v.29, p.1803-1808, 1999. Disponível em:
<www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10616926>. Acesso em: 15 abr. 2013.
doi:10.1016/S0020-7519(99)00146-0.
www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10616926...
, que, realizando ELISA
com EMA-2 expressa em baculovírus, também demonstraram diferença entre amostras de soros
positivos e negativos de equinos para T. equi. Entretanto, não estudaram
especificidade e sensibilidade e não houve comparação com teste padrão.
: Western Blot. A- Western Blot da proteína rEMA com anticorpo anti-histidina C-terminal (HRP Ab) - Invitrogen - (M) Marcador de proteínas - Bench Mark(tm) - (EMA-2) Proteína rEMA-2. (C-) Controle negativo, BSA 10%. B- Western Blot da proteína rEMA com soro equino (+). (M) Marcador de proteínas Precision Plus Protein Dual Color Standards - Bio-Rad, (S-) Controle negativo- soro equino (-), (S+) Soros positivos.
: Análise ROC do ELISA, IFAT comparando com ELISA padrão. (0) Soros negativos, (1) Soros positivos. A - Análise ROC do ELISA com ELISA padrão, identificando ponto de corte >0,22. B - Análise ROC do ELISA padrão com IFAT, identificando ponto de corte >0,418. C - Análise ROC do ELISA com IFAT, identificando ponto de corte >0,22.
Ao comparar ELISA padrão ao IFAT, obteve-se uma especificidade de 100%, mas
sensibilidade de apenas 35,5% (Figura 2B). O ELISA
teste, ao ser comparado ao IFAT, apresentou especificidade de 80,6% e sensibilidade de
75% (Figura 2C). Os resultados obtidos nos apontam
a subjetividade do teste de imunofluorescência e a possibilidade de reações cruzadas,
devido à sensibilização da lâmina com eritrócitos de equinos infectados com o parasita
(NIZOLI et al., 2009NIZOLI, L. Q. et al. Immunogenicity and antigenicity of the recombinant
EMA-1 protein of Theileria equi expressed in the yeast Pichia pastoris. Brazil.
Journal, Veterinary Parasitology v.18, n.2, p.1-4, 2009. Disponível em:
<http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S1984-296120090
00200001&script=sci_arttext.>. Acesso em: 15 abr. 2013.
doi:10.4322/rbpv.01802001.
http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S198...
).
O presente trabalho ficou limitado pela não realização de testes cruzados com outros
hemoparasitas e pelo número de animais estudados. Entretanto, TANAKA et al. (1999)TANAKA, T. et al. Expression of Babesia equi merozoite antigen-2 by
recombinant baculovirus and its use in the ELISA. International journal for
Parasitology, v.29, p.1803-1808, 1999. Disponível em:
<www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10616926>. Acesso em: 15 abr. 2013.
doi:10.1016/S0020-7519(99)00146-0.
www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10616926...
, KUMAR et al.
(2013)KUMAR, S. et al. Development of EMA-2 recombinant antigen based
enzyme-linked immunosorbent assay for seroprevalence studies of Theileria equi
infection in Indian equine population. Veterinary Parasitology, v.198, p.10-17, 2013.
Disponível em: <www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0304401713004949>.
Acesso em: 01 fev. 2014. doi: 10.1016/j.vetpar.2013.08.030.
www.sciencedirect.com/science/article/pi...
, utilizando rEMA-2 como antígeno, em amostras de soros positivas para
B. caballi, Trypanosoma evansi, mormo, anemia equina e influenza equina
não observaram reações cruzadas. Com um maior número de soros testados, seria possível
obter resultados diferentes, quanto aos valores de especificidade e sensibilidade.
CONCLUSÃO:
O estudo demonstrou que a proteína rEMA-2 expressa em P. pastoris é um promissor antígeno para utilização em testes de imunodiagnóstico para theileriose equina.
AGRADECIMENTOS
Agradecemos ao Programa de Pós-Graduação em Veterinária (PPGV) e ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia (CDTec) e a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela concessão de bolsas para A.M.V.
- BALDANI, C.D. et al. Production of recombinant EMA-1 protein and its application for the diagnosis of Theileria equi using an enzyme immunoassay in horses from São Paulo State, Brazil. Revista Brasileira Parasitologia Veterinária, v.20, n.1, p.54-60, 2011. Disponível em: <www.scielo.br/pdf/rbpv/v20n1/a11v20n1>. Acesso em: 03 jun. 2013. doi: 10.1590/S1984-29612011000100011.
» https://doi.org/10.1590/S1984-29612011000100011» www.scielo.br/pdf/rbpv/v20n1/a11v20n1 - BHOORA, R. et al. Sequence heterogeneity i the equi merozoite antigen gene (ema-1) of Theileria equi and development of na ema-1-specific Taq-Man MGB assay for the detection of T. equi. Veterinary Parasitology, v.172, n.1-2, p.33-45, 2010. Disponível em: <www.ncbi.nln.nih.gov/pubmed/?term=EMA-1+ and+Bhoora>. Acesso em: 04 fev. 2014. doi: 10.1016/j.vetpar.2010.04.025.
» https://doi.org/10.1016/j.vetpar.2010.04.025» www.ncbi.nln.nih.gov/pubmed/?term=EMA-1+ and+Bhoora - BRADFORD, M. Analytical biochemistry. v.72, p.248-254, 1976. Disponível em: <http://www.ciens.ucv.ve:8080/generador/sites/lab-bioq-gen/archivos/Bradford%201976.pdf>. Acesso em: 10 out. 2013.
» http://www.ciens.ucv.ve:8080/generador/sites/lab-bioq-gen/archivos/Bradford%201976.pdf - CEREGHINO, J.L.; CREGG, J.M. Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. FEMS Microbiology Reviews, v.24, n.1, p.45-66, 2000. Disponível em: <www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10640598>. Acesso em: 20 maio 2013. doi: 10.1111/j.1574-6976.2000.tb00532.x.
» https://doi.org/10.1111/j.1574-6976.2000.tb00532.x» www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10640598 - HARTWIG, D.D. et al. High yield expression of leptospirosis vaccine candidates LigA and Lig32 in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. Microbial Cell Factories, v.9, p.98, 2010. Disponível em: <http://www.microbialcellfactories.com/cont ent/ 9/1/98>. Acesso em: 04 fev. 2014. doi: 10.1186/1475-2859-9-98.
» https://doi.org/10.1186/1475-2859-9-98» http://www.microbialcellfactories.com/cont ent/ 9/1/98 - HEIM, A. et al. Detection and molecular characterization of Babesia caballi and Theileria equi isolates from endemic areas of Brazil. Parasitology Research, v.102, p.63-68, 2007. Disponível em: <www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17828553>. Acesso em: 03 jun. 2013. doi: 10.1007/s00436-007-0726.
» https://doi.org/10.1007/s00436-007-0726» www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17828553 - HIRATA, H. et al. Cloning of a truncated Babesia equi gene encoding an 82-kilodalton protein and its potential use in an enzyme-linked immunosorbent assay. Journal of Clinical Microbiology, v.40, p.1470-1474, 2002. Disponível em: <www.ncbi.nlm.nih.gov>. Acesso em: 03 fev. 2014. doi: 10.1128/JCM.40.4.1470-1474.2002.
» https://doi.org/10.1128/JCM.40.4.1470-1474.2002» www.ncbi.nlm.nih.gov - HIRATA, H. et al. Cloning of a novel Babesia equi gene encoding a 158-kilodalton protein useful for serological diagnosis. Clinical and Vaccine Immunology, v.12, n.2, p.334-338, 2005. Disponível em: <http://cvi.asm.org/content/12/2/334.short>. Acesso em: 03 fev. 2014. doi: 10.1128/CDLI.12.2.334-338.2005.
» https://doi.org/10.1128/CDLI.12.2.334-338.2005» http://cvi.asm.org/content/12/2/334.short - HUANG, X. et al. High-Level expression and purification of a truncated Merozoite Antigen-2 of Babesia equi in Escherichia coli and its potential for immunodiagnosis. Journal of Clinical Microbiology, v.41, p.1147-1151, 2003. Disponível em: <www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12624044>. Acesso em: 03 jun. 2013. doi: 10.1128/JCM.41.3.1147-1151.
» https://doi.org/10.1128/JCM.41.3.1147-1151» www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12624044 - HUANG, X. et al. Evaluation of enzyme-linked immunosorbent assays with recombinant antigens for the serodiagnosis of equine Babesia infections. Veterinary Parasitology, Short communication, 2006. Disponível em: <www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16621293>. Acesso em: 03 jun. 2013. doi: 10.1016/j.vetpar.2006.03.013.
» https://doi.org/10.1016/j.vetpar.2006.03.013» www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16621293 - KNOWLES, D.P. et al. Antibody to a recombinant merozoite protein epitope identifies horses infected with Babesia equi. Journal of Clinical Microbiology, v.30, p.3122-3126, 1992. Disponível em: <http://jcm.asm.org/content/30/12/3122>. Acesso em: 31 jan. 2013.
» http://jcm.asm.org/content/30/12/3122 - KUMAR, S. et al. Expression of Babesia equi EMA-1 and EMA-2 during merozoite developmental stages in erythrocyte and their interaction with erythrocytic membrane skeleton. Molecular and Biochemical Parasitology, v.133, p.221-227, 2004. Disponível em: <www.ncbi.nim.nih.gov/pubmed/14698434>. Acesso em: 08 out. 2013. doi: 10.1016/j.molbiopara.2003.10.010.
» https://doi.org/10.1016/j.molbiopara.2003.10.010» www.ncbi.nim.nih.gov/pubmed/14698434 - KUMAR, S. et al. Development of EMA-2 recombinant antigen based enzyme-linked immunosorbent assay for seroprevalence studies of Theileria equi infection in Indian equine population. Veterinary Parasitology, v.198, p.10-17, 2013. Disponível em: <www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0304401713004949>. Acesso em: 01 fev. 2014. doi: 10.1016/j.vetpar.2013.08.030.
» https://doi.org/10.1016/j.vetpar.2013.08.030» www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0304401713004949 - MEALEY, R.H. et al. Protective effects of passively transferred merozoite-specific antibodies against Theileria equi in horses with severe combined immunodeficiency. Clinical and Vaccine Immunology, v.19, n.1, p.100-104, 2012. Disponível em: <www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22038847>. Acesso em: 20 maio 2013. doi: 10.1128/CVI.05301-11.
» https://doi.org/10.1128/CVI.05301-11» www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22038847 - MEHLHORN, H.; SCHEIN, E. Redescription of Babesia equi Laveran, 1901 as Theileria equi Mehlhorn, Schein 1998. Parasitology Research, v.84, p.467-475, 1998. Disponível em: <http://link.springer.com/article/10.1007/s004360050431#page-1>. Acesso em: 20 maio 2013. doi: 10.1007/s004360050431.
» https://doi.org/10.1007/s004360050431» http://link.springer.com/article/10.1007/s004360050431#page-1 - MILLER, S.A. et al. A simples salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Research, v.6, p.1215, 1988. Disponível em: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC334765/>. Acesso em: 3 maio 2013. doi: 10.1093/nar/16.3.1215.
» https://doi.org/10.1093/nar/16.3.1215» http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC334765/ - MUNKHJARGAL, T. et al. Prevalence and genetic diversity of equine piroplasms in Tov province, Mongolia. Infection Genetic Evolution, v.16, p.178-185, 2013. Disponível em: <www.ncbi.nln.nih.gov/pubmed/23416256>. Acesso em: 04 fev. 2014. doi: 10.1016/j.meegid.2013.02.005.
» https://doi.org/10.1016/j.meegid.2013.02.005» www.ncbi.nln.nih.gov/pubmed/23416256 - NIZOLI, L. Q. et al. Immunogenicity and antigenicity of the recombinant EMA-1 protein of Theileria equi expressed in the yeast Pichia pastoris. Brazil. Journal, Veterinary Parasitology v.18, n.2, p.1-4, 2009. Disponível em: <http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S1984-296120090 00200001&script=sci_arttext.>. Acesso em: 15 abr. 2013. doi:10.4322/rbpv.01802001.
» https://doi.org/10.4322/rbpv.01802001» http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S1984-296120090 00200001&script=sci_arttext - OFFICE INTERNATIONAL DES EPIZOOTIES (OIE). Equine piroplasmosis. In: Manual of diagnostic and vaccines for terrestrial animals, 2008. CHAPTER 2.5.8. Disponível em: <http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.05.08_EQUINE_PIROPLASMOSIS.PDF>. Acesso em: 05 fev. 2014.
» http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.05.08_EQUINE_PIROPLASMOSIS.PDF - OFFICE INTERNATIONAL DES EPIZOOTIES (OIE). Pruebas de diagnóstico prescritas y de sustitución para las enfermedades de la lista de la OIE, 2010. Disponível em: <http://www.oie.int/fileadmin/Home/esp/Health_standards/tahc/2010/es_chapitre_1.1.3.htm>.Acesso em: 23 out. 2012.
» http://www.oie.int/fileadmin/Home/esp/Health_standards/tahc/2010/es_chapitre_1.1.3.htm - RAMPERSAD, J. et al. A field evaluation of PCR for the routine detection of Babesia equi in horses. Veterinary Parasitology, v.114, p.81-87, 2003. Disponível em: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12781470>. Acesso em: 03 maio 2013. doi: 10.1016/S0304-4017(03)00129-8.
» https://doi.org/10.1016/S0304-4017(03)00129-8» http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12781470 - SAMBROOK, J.; RUSSEL, D.W. Molecular cloning. A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 2001. p.9.16-9.17.
- TANAKA, T. et al. Expression of Babesia equi merozoite antigen-2 by recombinant baculovirus and its use in the ELISA. International journal for Parasitology, v.29, p.1803-1808, 1999. Disponível em: <www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10616926>. Acesso em: 15 abr. 2013. doi:10.1016/S0020-7519(99)00146-0.
» https://doi.org/10.1016/S0020-7519(99)00146-0» www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10616926 - UILENBERG, G. Babesia - A historical overview. Veterinary Parasitology, v.138, p.3-10, 2006. Disponível em: <www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16513280>. Acesso em: 20 out. 2012. doi: 10.1016/j.vetpar.2006.01.035.
» https://doi.org/10.1016/j.vetpar.2006.01.035» www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16513280 - UETI, M.W. et al. Expression of Equi merozoite Antigen 2 during development of Babesia equi in the midgut and salivary gland of the vector tick Boophilus microplus. Journal of Clinical Microbiology, v.41, p.5803-5809, 2003. Disponível em: <www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14662988>. Acesso em: 3 maio 2013. doi: 10.1128/JMC.41.12.5803-5809.2003.
» https://doi.org/10.1128/JMC.41.12.5803-5809.2003» www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14662988
Datas de Publicação
-
Publicação nesta coleção
Out 2014
Histórico
-
Recebido
28 Jul 2013 -
Aceito
24 Mar 2014