Formulação de meios de cultivo à base de soro de leite para a produção de goma xantana por X. Campestris C7L

Formulation of whey-based media for xanthan gum production by X. Campestris C7L isolate

FORMULAÇÃO DE MEIOS DE CULTIVO À BASE DE SORO DE LEITE PARA A PRODUÇÃO DE GOMA XANTANA POR X. campestris C₇L¹

Marcia NITSCHKE^{2 *}, Vanessa RODRIGUES³, Lisiane Fiorio SCHINATTO⁴

RESUMO

A goma xantana é um polissacarídeo microbiano de grande significado comercial especialmente para a indústria de alimentos. O objetivo deste trabalho foi avaliar a produção de xantana em diferentes meios de cultura à base de soro de leite utilizando o isolado Xanthomonas campestris C₇L. Dentre as formulações testadas o meio de soro de leite integral produziu maior viscosidade e concentração final de xantana. Um sistema combinando soro integral (0,35% de proteína) e soro filtrado (0,18%de proteína) foi proposto. Na primeira fase em soro integral a produção de xantana foi de 13g/L e 45% de rendimento,enquanto que na segunda fase utilizando-se soro filtrado obteve-se um total de 28g/L de xantana e 75% de rendimento. O rendimento geral do processo foi de 55% e a viscosidade final do meio atingiu 18000cP. As soluções de xantana produzidas em soro de leite apresentaram comportamento pseudoplástico e tixotrópico característicos deste tipo de polímero. O isolado C₇L demonstrou capacidade de produzir gomas de alta viscosidade e qualidade em soro de leite, constituindo uma alternativa promissora para a produção industrial de goma xantana a partir deste subproduto.

Palavras- chave: xantana; soro de leite; Xanthomonas campestris

SUMMARY

FORMULATION OF WHEY-BASED MEDIA FOR XANTHAN GUM PRODUCTION BY X. campestris C₇L ISOLATE. Xanthan gum is a microbial polysaccharide of great commercial interest, especially in the food industry. The aim of this work was the evaluation of xanthan gum production from different whey - based media by a lactose utilizing Xanthomonas campestris C₇L isolate. Three whey media formulations were tested: unfiltered whey, filtered whey and hydrolyzed whey. The medium composed of unfiltered whey showed the highest viscosities and xanthan concentrations. A two stage fermentation strategy, combining unfiltered whey (0,35% protein) and filtered whey (0,18% protein), was proposed. The first stage, using unfiltered whey medium, showed a xanthan production of 12g/L and a 45% yield. The second stage, with filtered whey addition, gave final xanthan concentration of 28g/L and a 75% yield. The overall yield was 55% and final broth viscosity reached 18000cP. The polymer produced in this combining system showed typical pseudoplastic and thixotropic behavior. The X. campestris C₇L isolate produced high viscosity broths and high quality gums when using whey as substrate and constitutes a promising option for the industrial production of xanthan gum from whey.

Keywords: xanthan; whey; Xanthomonas campestris

1 ¾ INTRODUÇÃO

A goma xantana é um polissacarídeo microbiano produzido por linhagens de Xanthomonas campestris. Pelo fato de possuir propriedades reológicas únicas, a xantana vem sendo amplamente utilizada como agente suspensivo, espessante, emulsionante e estabilizante principalmente na indústria de alimentos [9,20]. A xantana também encontra aplicação em uma grande variedade de processos industriais , sendo aplicada em grande escala na recuperação secundária e terciária do petróleo [3].

Devido ao mercado crescente, muitos estudos têm sido conduzidos objetivando o melhoramento das linhagens, dos meios de cultivo e dos processos de extração e purificação de goma xantana. A maior parte da literatura referente à produção de xantana cita o uso de glicose e sacarose como fontes de carbono preferenciais [11,17], entretanto algumas fontes alternativas têm sido sugeridas [1,24], visando principalmente o aproveitamento de resíduos industriais e diminuição nos custos de produção. O soro de leite, resultante da fabricação de queijos, vem sendo estudado como alternativa [15,16,18,21]. A produção diária de soro de leite atinge quantidades muito elevadas e seu descarte representa um sério problema ambiental [21], entretanto possui alto teor de lactose além de proteínas, e sais minerais constituindo um meio de cultura rico e de fácil obtenção. O principal problema encontrado na produção de xantana em soro de leite é a baixa capacidade de utilização de lactose por X. campestris, fato este que se deve à baixa afinidade da b-galactosidase da bactéria por lactose [6]. A utilização de linhagens genéticamente modificadas também foi proposta [8,13,23] porém, as culturas demonstraram pouca estabilidade e gomas de qualidade inferior. Em estudo anterior foi relatada a seleção de isolados selvagens de X. campestris com capacidade para a produção de xantana a partir de lactose [12]. O presente trabalho teve por objetivo estudar diferentes formulações de meios de cultura à base de soro de leite, visando a utilização deste subproduto, para a produção de xantana pelo isolado X. campestris C₇L.

2 ¾ MATERIAL E MÉTODOS

2.1 ¾ Microrganismo

Utilizou-se o isolado Xanthomonas campestris C₇L obtido em trabalho anterior [12].

2.2 ¾ Meios de cultura

Para a manutenção do isolado utilizou-se meio mínimo de lactose contendo 1,5% lactose, 0,5% K₂HPO₄, 0,2% NH₄Cl, 0,1% NaCl, 0,01% MgSO₄ e 0,1% extrato de levedura (pH 7,0-7,2). O soro em pó foi cedido gentilmente pela ELEGE Alimentos LTDA ( Porto Alegre, RS), tendo na sua composição 1,0% gordura, 76,81% lactose, 12,03% proteína, 8,67% sais minerais e 0,065% ácido lático.

Meio de soro de leite integral: solução aquosa a 4% (p/v) de soro de leite em pó, MgSO₄ 0,01% e K₂HPO₄ 0,5% (pH 7,2). Após a autoclavagem o meio de soro apresentou um aspecto bastante turvo permanecendo com as proteínas insolúveis.

Meio de soro filtrado : foi preparado meio de soro integral que após a esterilização em autoclave foi filtrado assepticamente, obtendo-se um meio de aspecto límpido (proteínas precipitadas durante autoclavagem foram eliminadas).

Meio de soro de leite hidrolisado : preparou-se soro integral adicionando-se b-galactosidade (Lactozim 3000L HP-G, Novo Nordisk) nas condições especificadas pelo fabricante.

2.3 ¾ Inóculo e condições de cultivo

O inóculo foi preparado a partir de um tubo de ágar inclinado em meio lac-min [16]. Uma alça contendo cultura de 24 horas foi inoculada em tubo de ensaio contendo 5mL de caldo lac-min e incubado em agitador rotatório por 24 horas a 160rpm e 28°C num ângulo de inclinação de aproximadamente 30°. A cultura resultante (10mL) foi transferida para erlenmeyer de 500mL contendo 90mL do respectivo meio de soro e incubada novamente por 72 horas à 200rpm e 28°C.

2.4 ¾ Sistema alimentado

O ensaio combinando dois tipos de meio (soro integral e soro filtrado) foi conduzido em fermentador de 16L (New Brunswick SF-116) contendo inicialmente 6L de meio de soro integral. O inóculo foi preparado como anteriormente e adicionado na proporção de 10%(v/v) do volume total de meio. A temperatura foi mantida em 30°C, aeração 1vvm, pH controlado automaticamente para 7,0 e a velocidade de agitação foi programada para manter o oxigênio dissolvido ( DO) > 50%. Quando a concentração de lactose no meio atingiu aproximadamente 3g/L adicionou-se assepticamente 1L de soro de leite filtrado preparado na concentração de 20% (p/v).

2.5 ¾ Determinações analíticas

A concentração de lactose e açúcares redutores totais (ART) foram determinadas pelo método do ácido dinitrosalicílico (DNS). A glicose foi determinada por método enzimático (Glicose oxidase- Ecoline 250- Merck). O teor de galactose foi determinado enzimaticamente (lactose/D-galactose -Boehringer Mannheim). Proteína por nitrogênio total (Kjeldahl).

Para a determinação de xantana uma alíquota do meio foi diluída em água destilada (10x) e centrifugada (13000 x g). O sobrenadante foi adicionado de 1% de KCl agitado em agitador magnético por 15 minutos e adicionado de três volumes de álcool etílico 96° para a precipitação da goma. O produto obtido foi filtrado à vácuo, seco em estufa 55°C por 12 horas e colocado em dessecador à temperatura ambiente até peso constante. A viscosidade dos meios de cultivo foi determinada em viscosímetro Brookfield tipo Cone/Plate spindle CP-52, 0.6 rpm à 25°C. Para estudo de reologia procedeu-se a purificação da xantana: a goma foi redissolvida a 1% em água destilada, novamente centrifugada (13000xg). O sobrenadante foi filtrado em membrana tipo Millipore (0,45mm) e adicionado de 3 volumes de álcool etílico 96°. O precipitado foi submetido à secagem em estufa (55°C) e moagem e mantido em dessecador. Preparou-se uma solução aquosa a 1% da goma purificada adicionada de 0,1% de KCl. As viscosidades foram medidas a 25°C em viscosímetro Brookfield LVTDV-II usando spindle número 3, sob diferentes taxas de cizalhamento. Todas as determinações foram realizadas em triplicata.

3 ¾ RESULTADOS E DISCUSSÃO

Na Tabela 1 são mostrados os resultados da produção de xantana pelo isolado C₇L em 3 tipos diferentes de formulações à base de soro de leite. Observa-se que o meio de soro integral apresentou maior viscosidade final em relação aos outros meios testados. Este fato sugere que a goma produzida em soro integral apresenta maior qualidade ou seja, maior viscosidade gerada por unidade de polímero produzido, enquanto que em meio de soro filtrado a xantana produzida possui qualidade inferior ou seja, menor viscosidade gerada por unidade de polímero produzido.

No soro hidrolisado observou-se uma preferência pelo uso de glicose e galactose em relação à lactose presente no meio, entretanto este fato não se refletiu em maior produção de xantana. Cabe ressaltar, que o microrganismo utilizou glicose e galactose concomitantemente, não exibindo preferência por um desses açúcares. A lactose residual foi consumida mais lentamente e preferentemente na fase de acúmulo de polímero (Figura 1). SCHWARTZ e BODIE [16] utilizando um isolado adaptado à lactose, verificaram que, quando a glicose foi adicionada a um meio contendo soro de leite, a lactose deixava de ser utilizada. O isolado C₇L não demonstrou preferência estrita por glicose (e ou galactose), ou seja, utilizou a lactose mesmo na presença dos monossacarídeos, principalmente a partir de 48 horas de cultivo, quando se inicia a produção de xantana, indicando a adaptação deste microrganismo à utilização de lactose para a produção do polissacarídeo.

A relação C/N no meio de cultura influencia grandemente a produção de xantana. Segundo Sutherland [19], uma elevada concentração de nitrogênio é necessária para um rápido crescimento celular entretanto, quando a concentração de nitrogênio no meio de cultura for muito elevada, a xantana produzida possui propriedades reológicas inadequadas [ 2].

Meios contendo elevado teor de fonte de carbono e baixo teor de nitrogênio favorece o acúmulo de polímero [4]. Em geral os processos industriais procuram utilizar meios que disponibilizem condições tanto para o crescimento como para o acúmulo de goma [22]. De VUYST, VAN-LOO, VANDAMME [5] verificaram que a xantana é produzida como metabólito secundário e propuseram a dissociação do processo em duas fases distintas: a fase de crescimento, onde maior concentração de nitrogênio é requerida para o crescimento celular e a fase de produção, onde maior concentração de carbono é necessária, visando o acúmulo de produto [10]. Baseado nesses fatos, propôs-se um sistema combinado em duas etapas utilizando soro integral (0,35% proteína) na primeira etapa e soro filtrado ( 0,18% proteína) na segunda etapa.

A Figura 2 mostra os resultados da produção de xantana no sistema combinado.

Na primeira etapa obteve-se 13g/Kg de xantana e um rendimento de 45%. Após 30 horas de processo a adição de soro filtrado produziu 28g/Kg de xantana e um rendimento de 75%. Depois de 70 horas o rendimento total atingiu 55% e a viscosidade final do meio foi de 18000cP. No início do processo, o uso do soro integral favoreceu o crescimento celular, enquanto que na segunda fase, a adição de soro filtrado contendo menor concentração de proteínas favoreceu o acúmulo do produto. De fato, a relação C/N do meio parece ser o fator mais importante na produção de xantana , uma vez que a adição de soro integral na segunda etapa também mostrou concentrações de xantana e rendimento semelhante aos encontrados na primeira etapa. Por outro lado, a utilização de soro filtrado na primeira etapa mostrou produções de gomas de baixa viscosidade (Tabela 1).

Para a caracterização reológica da goma xantana produzida em soro de leite, verificou-se a influência da taxa de cizalhamento na viscosidade do polímero (Figura 3). Observa-se um comportamento pseudoplástico ou seja, diminuição da viscosidade à medida que aumenta a taxa de cizalhamento. Este comportamento é típico de soluções de xantana. Observa-se leve comportamento tixotrópico, que também foi relatado por SANDFORD et al [14] que relacionaram o comportamento tixotrópico com o conteúdo de piruvato presente na xantana. Gomas com elevado teor de piruvato exibiram leve comportamento tixotrópico, enquanto gomas com baixo teor de piruvato, não demonstraram esse comportamento. Sabe-se, que o conteúdo de piruvato é um indicativo da qualidade da goma xantana [7] portanto, os resultados obtidos sugerem que a goma xantana produzida em soro de leite possui características reológicas adequadas a um produto de boa qualidade. Entretanto, futuros testes devem ser conduzidos visando a melhor caracterização química e reológica da xantana produzida pelo isolado C₇L em soro de leite.

4 ¾ CONCLUSÕES

• O meio de cultura à base de soro de leite integral demonstrou os melhores resultados dentre os meios testados.

• Em soro de leite hidrolisado, a partir de 48 horas de cultivo, o isolado C₇L demonstrou capacidade de utilização de lactose independente da presença de glicose e galactose.

• A estratégia de combinar meio à base de soro de leite integral e filtrado aumentou o rendimento e a concentração final de xantana.

• A xantana produzida em meios de soro de leite exibiu comportamento pseudoplástico e tixotrópico característicos.

• o isolado Xanthomonas campestris C₇L possui capacidade para utilização do soro de leite como substrato constituindo uma alternativa promissora para a produção de goma xantana a partir deste resíduo.

5 ¾ REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

² UNICAMP-FEA - Departamento de Ciência de Alimentos- Laboratório de Bioquímica. Cx Postal 6121 CEP 13083-970 Campinas ¾ SP

³ Centro de Pesquisa em Alimentação (CEPA) - UPF ¾ Passo Fundo, RS

⁴ Estudante do Curso de Farmácia - UPF- RS

* A quem a correspondência deve ser enviada.

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Recebido para publicação em 12/09/00. Aceito para publicação em 06/03/01.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  31 Ago 2001
• Data do Fascículo
  Jan 2001

Histórico

• Recebido
  12 Set 2000
• Aceito
  06 Mar 2001