ANTIBIOSE E TOXIDEZ DE EXTRATOS DE CAULE DE VERNONIA SCORPIOIDES (Lam.) Pers. (ASTERACEAE).

RESUMO

As propriedades antifúngicas de 2 extratos, obtidos a partir de caules de Vernonia scorpioides (Lam.) Pers., foram testadas para Penicillium citrinum, produtor de micotoxina nefrotóxica. Os extratos foram utilizados em ensaio de antibios e pelo método de difusão em agar, nas concentrações de 1 mg. 3 mg e 5 mg para cada 100 l de diluente, originando halos de inibição com 40, 50 e 80 mm, respectivamente. Tal resultado sugeriu ação fungicida, uma vez que não se conseguiu, à partir dos tratamentos, realizar-se subcultivos em meio Czapeck-Dox isento de inibidores. Foi avaliada a toxidez desses extratos ativos para camundongos albinos, aos quais ministrou-se uma dose cem vezes superior à utilizada in vitro. Não houve interferência no estado geral, ou ganho de peso, dos animais tratados durante 6 dias subsequentes a administração oral dos extratos. Através dos espectros no infravermelho dos extratas ativos, observou-se a existência de sinais, característicos do estiramento de carbonilas lactônicas (com absorção entre 1750 cm^-1 e 1770 cm^-1).

Palavras chave:
Penicillium citrinum; Vernonia scorpioides; atividade biológica; lactonas sesquiterpênicas

ABSTRACT

In order to identify bioactive compounds against the nephrotoxic mycotoxin producer fungi Penicillium citrinum, two extracts, obtained from stalksof of Vernonia scorpioides, were studied. Antibiosis assays were doneat the concentrations of 1. 0,3.0 and 5.0 g / 0.1 ml of diluent. It was determined 40.0. 50,0 and 80.0 mm broadness for the inhibition halos of each assayed concentration, respectively. These results are suggestive of a fungicide activity, once neither one subculture could be achieved when the treated materials were cultivated in a freed of inhibitors Czapeck-Dox medium. These active extracts were also assayed for toxicity in albino mice, showing no interference on their general aspects or body-weight gam 6 days after the oral administration. The infrared spectroscopy of the bioactive extracts showed a charaderistic absorptionofladone carbonyls ( between 1750 cm^-1 and 1770 cm^-1), also suggesting that sesquiterpeneladones were the main produd in the bioadive extracts.

Key words:
Penicillium citrinum; Vernonia scorpioides; biological activity; sesquiterpene lactones

INTRODUÇÃO

Espécies de fungos tais como alguns do gênero Penicillium, quando submetidos a condições favoráveis de temperatura e umidade, produzem metabólitos especiais de efeitos tóxicos extremamente nocivos (micotoxinas). Oportunisticamente, esses microorganismos são dispersados pelo vento, na sua forma reprodutiva (esporos), e infectam as plantas, através de suas inflorescências, penetram através dos estigmas e alojam-se nos ovários. Por ocasião do armazenamento e transporte dos grãos, gerados por essas flores infectadas, os fungos proliferam e produzem as micotoxinas. Os efeitos observados das micotoxinas são devastadores, todas são potencialmente cancerígenas e que mesmo quando ingeridas em concentrações muito baixas podem levara supressão imunológica, dando origem a falhas vacinais e inúmeras infecções de caráter secundário (SMITH & MOSS, 1985; FREIRE et al, 1994).

É de extrema relevância o desenvolvimento de estratégias para eliminar fungos, assim como seus produtos de secreção e excreção, visando proteger a integridade biológica de homens e animais. Com este intuito, as modalidades de controle, baseadas na utilização de princípios ativos de plantas medicinais, de atividade biológica definida e sem toxidez, teriam grande utilidade prática (GOTTLIEB & KAPLAN, 1993). Pesquisadores do governo Indiano testaram com sucesso extratos de Andrografhis peniculata - fam. Acantaceae para controlar o crescimento de Aspergillus flavus, produtor de aflatoxinas (KUMAR & PRASAD, 1992), assim como o Centro de Pesquisas Vegetais do Canadá, desenvolve intensas investigações sobre a ação de metabólitos especiais, de plantas da família Asteraceae, sobre diferentes espécies de fungos fitopatogênicos (PICMAN & SCHINEIDER, 1993). O presente trabalho foi realizado com o intuito de se verificar a possiivel utilização dos extratos hexânico e clorofórmico de caules V. scorpioides como antifúngicos, se conhecer o grupo de substâncias responsáveis pela atividade, além de se avaliar uma possível toxidez desses extratos.

MATERIAL E MÉTODOS

Preparo do material

Os caules de Vernonia scorpioides (Lam.) Pers. foram colhidos no campus da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, durante o mês de setembro de 1993. O material foi posto a secar uma temperatura controlada de 411°C. Em seguida foi granulado e padronizado em tamis com 40-80 mesh de diâmetro (Granutex-Brasil).

O material granulado foi submetido a um processo de extração contínua em aparelho de soxhlet com hexano e clorofórmio.

As amostras obtidas foram concentradas em rotavapor(Büchi-Suiça) e evaporadas em capela de exaustão durante 72 horas. A seguir foram pesadas e tiveram o seu rendimento calculado em função da razão entre o peso bruto do material granulado pelo peso dos extratos secos.

Caracterização físico-química

Os extratos de Vernonia scorpioides foram caracterizados físico -quimicamente no infravermelho em aparelho Peerkin Elmer-EUA no Instituto de Química da UFRRJ, os espectros foram registrados em pastilhas de KBr ou NaCl.

Os extratos foram solubilizados em dimetilsufóxido (DMSO -Vetec-Brasil); e posteriormente diluídos v/v em solução salina tamponada (PBS) (8,00 g/l de NaCl; 0,20 g/l de KCl; 1,15 g/l Na2HPO 4; 0,20g/l de NaH2 PO4).

Ensaio de antibiose

Foi realizado segundo metodologia descrita por FREIRE (1995),

Utilizou-se placas de Petri convencionais, contendo 25 ml de meio solidificado, previamente inoculado com Penicilium citrinum, para ensaio de difusão em agar, tal como descrito por DAVINO (1989). Foram feitas escavações centralizadas com auxílio de um tubo de vidro ligado a uma linha de vácuo (bomba de vácuo Motors Elétricos - Brasil). Entre o bastão e a bomba foi acoplado um kitasato para recolhimento do agar infectado. Os orifícios resultantes foram padronizados em 1 cm de diâmetro, no seu interior adicionou-se os extratos hexânico e clorofórmico na proporção de 1,0; 3,0 e 5,0 mg por 0,1 ml de diluente por placa. Os halos obtidos foram medidos com auxílio de um paquímetro (Mitutoyo-Japão). Todo procedimento foi realizado em condições assépticas. Cada tratamento contou com 3 repetições e a cada concentração somaram-se as testemunhas que eram constituídas de placas com inóculo fúngico e adicionadas de solventes utilizados na extração ou do diluente utilizado, na proporção de 50% com PBS.

Modo de ação dos extratos.

Visando determinar se os extratos ativos de V. scorpioides possuíam atividade fungicida ou fungistática, retirou-se alíquotas com alça de platina estéril de cada um dos tratamentos anteriores, com período de incubação de 72 horas, e procedeu-se a semeadura em Czapeck-Dox-agar inclinado, em tubos de ensaio e livres de extratos. Os tubos foram identificados e incubados a temperatura ambiente durante 20 dias. O crescimento fúngico foi verificado visualmente. Todos os tratamentos contaram com três repetições e controle, que consistia em se executar o mesmo procedimento descrito com as placas testemunha (isentas de extratos).

Ensaio de toxidez

Camundongos albinos (Swiss Webstern), machos, pesando 14-16 gramas foram inoculados por via oral, através de canulação, com os extratos hexanico eclorofórmico. Esses mesmos extratos, contendo 100 vezes a concentração utilizada nos testes de antibiose por kg de peso, foram diluídos em DMSO a 50% em solução salina isotônica e administrados aos animais. Os camundongos foram mantidos em gaiolas apropriadas forradas com serragem autoclavada, além de ração para roedores comercial (Labina) e água potável a vontade. Os animais foram pesados diariamente e observados durante 6 dias. Formou-se um grupo controle constituído de animais que não receberam extratos. O desenvolvimento ponderai, assim como a sobrevida dos animais foram observados diariamente.

O delineamento experimental adotado foi um split-splot com três repetições por tratamento. Os resultados obtidos foram então submetidos ao teste de médias Dunnet (GILL, 1978).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O rendimento obtido nas extrações a partir de100 gramas de caule de Vernonia scorpioides resultou em 1,31 e 0,76 gramas de extratos hexânico e clorofórmico, respectivamente.

Os espectros no infravermelho dos extratos ativos apresentaram sinais (ombros) de estiramento de carbonila lactônica na região entre 1750 e 1770cm^-1, onde se encontram os sinais das lactonas sesquiterpênicas (WARNING et al, 1987), substâncias características da família Asteraceae e de atividade biológica descrita (KUPCHAM et al, 1968, ALARCON, 1990, KAIJ et al 1991. LOPES, 1991, PICMAN & SHNÈIDER, 1993). Algumas vezes esses sinais foram sobrepostos pela elevada intensidade de outro sinal, provavelmente em decorrência do estiramento de carbonila de éster alifático em 1725 cm^-1. (Figura 1)

O extratos hexânico e clorofórmico do caule de V. scorpioides mostraram-se potencialmente ativos contra o desenvolvimento de P. citrinum ). Havendo a formação de halos de inibição do crescimento fúngico de até 80 mm de diâmetro para o cultivo tratado com extrato clorofórmico (Figura 2). A utilização de solventes pouco polarescom obtenção satisfatória de extratos ativos, reforça a possibilidade detratarem-se de lactonas sesquiterpênicas, os princípios ativos que conferem atividade antifúngica à V. scorpioides. As placas testemunha não apresentaram qualquer efeito inibidor. Isto significa que as atividades biológicas são, antes de tudo, inerentes ao extrato e não podem ser atribuídas aos solventes.

Os dados relativos ao esse experimento foram submetidos a uma análise fatorial. O efeito da concentração se mostrou altamente significativa em todos nos doistratamentos, entretando não se detectou diferença significativa entre extratos. Os testes foram realizados ao nível de 1% de significância para Dunnet (VIEIRA & HOFFMANN, 1989).

Subcultivos, obtidos a partir de fungos previamente tratados com os extratos ativos, foram realizados em meio Czapeck-Dox isento de inibidores, ou antibióticos, mostrando-se sem atividade biológica. Estes dados são indicativos de uma ação biológica fungicida, nas concentrações utilizadas. Resultados semelhantes têm sido obtidos por diferentes pesquisadores, onde nos extratos de plantas pertencentes à família Asteraceae são encontradas lactonas sesquiterpênicas de diferentes tipos, com capacidade de inibir o crescimento de hifas de fungos patogênicos (DAVINO, 1989 e PICMAN & SHNEIDER, 1993).

Ensaios realizados em camundongos albinos, tratados com doses cem vezes superiores àquelas utilizadas nos ensaios "in vitro", demonstraram que os extratos obtidos não apresentaram toxicidade relevante, muito embora o extrato hexâníco tenha provocado irritação, taquicardia e desmaio em alguns animais, os quais recuperaram-se em pouco tempo, sem apresentar seqüelas, ou repetição do quadro. Provavelmente estes sintomas estão relacionados a resíduos de solventes adicionados ao extrato, uma vez que nos extratos clorofórmicos nada se observou de anormal nos animais tratados, quando comparados com animais do sistema controle, aos quais administrou-se somente o veículo (Figura 3). A análise estatística desses resultados comprovou não haver diferenças significativas entre os tratamentos quando analisados o ganho de peso dos animais, 1 % de significãncia para o teste de Dunnet (GILL, 1978).

FIGURA 1
Espectros no infravermelho relativos aos extratos hexânico (A) e clorofórmico (B).

FIGURA 2
Efeito dos extratos de caule sobre o desenvolvimento de esporos de Penicillium citrinum “in vitro” pelo método de difusão em agar, com a concentração de 3 mg de extrato para 0,1 ml de DMSO/PBS (v/v) A - hexanico, B - clorofórmico e C - DMSO/PBS (v/v).

FIGURA 3
Ganho de peso em gramas de camundongos albinos tratados com 500 mg/kg de extratos ativos de caule de Vernonia scorpioides.

CONCLUSÕES

Com base nos resultados obtidos pode-se concluir que os extratos hexãnico e clorofõmnico de caules de Vernonia scorpioides têm ação fungicida sobre Penicillium citrinum. Esses extratos concentram principio(s) ativo(s) que, provocam a morte fúngica e não apenas a estagnação do seu desenvolvimento, além de não apresentarem toxidez para camundongos albinos.

Embora não se tenha estudado quimicamente os extratos testados, há uma clara indicação de que a atividade observada em V. scorpioides se deva, pelo menos em parte, à presença de lactonas sesquiterpênicas, representando uma fonte inesgotável de matéria-prima bioativa, significando um caminho alternativo para produtos antifúngicos de grande potencialidade. Entretanto, há a necessidade de estudos mais profundos para que esta se transforme em um agente fungicida, seguro e atóxico.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  26 Fev 2024
• Data do Fascículo
  1996