Os mecanismos comportamentais pelos quais as larvas de populações Chilenas simpátricas de Drosophila melanogaster, D. simulans, D. hydei e D. busckii selecionam os locais de pupação são descritos em termos de preferências larvais pelos substratos. Essas espécies compartilham os mesmos locais de procriação no Vale Central do Chile. É importante investigar em populações naturais simpátricas de espécies de Drosophila os substratos preferenciais das larvas para pupar, porque este comportamento poderia contribuir para a coexistência da espécie na natureza. As larvas de D. busckii preferiram pupar em substratos úmidos com superfície lisa, enquanto que as larvas de D. simulans escolheram substratos úmidos com superfície áspera. As larvas de D. melanogaster preferiram substratos com superfície áspera, tanto úmidos como secos, enquanto que as larvas de D. hydei ocuparam substratos secos com superfície lisa. As larvas de D. melanogaster cavaram mais profundamente na areia seca do que na úmida, enquanto que as larvas de D. simulans cavaram mais na areia úmida. As larvas de D. busckii puparam nas camadas superficiais de areia tanto úmida como seca e as larvas de D. hydei cavaram mais na areia úmida do que na seca. As pupas das quatro espécies de Drosophila apresentaram distribuições agregadas nos substratos. Os comportamentos pré-pupação de larvas de D. melanogaster, D. simulans, D. hydei e D. busckii poderiam ser importantes para sua coexistência na natureza.