Avaliação das metodologias M.I.C.E.®, Etest® e microdiluição em caldo para determinação da CIM em isolados clínicos

Evaluation of M.I.C.E.TM, Etest® and CLSI broth microdilution methods for antimicrobial susceptibility testing of nosocomial bacterial isolates

ARTIGO ORIGINAL ORIGINAL PAPER

Avaliação das metodologias M.I.C.E.^®, Etest^® e microdiluição em caldo para determinação da CIM em isolados clínicos

Evaluation of M.I.C.E.^TM, Etest^® and CLSI broth microdilution methods for antimicrobial susceptibility testing of nosocomial bacterial isolates

Eloiza Helena Campana^I; Cecília Godoy Carvalhaes^II; Paula Peraro Barbosa^III; Antonia Maria de Oliveira Machado^IV; Ana Maria de Paula^V; Ana Cristina Gales^VI

^IFarmacêutica e bioquímica; mestre em Ciências; Laboratório Alerta/Laboratório Especial de Microbiologia Clínica (LEMC) da disciplina de Infectologia da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)

^IIPatologista Clínica; mestre em Ciências; Laboratório Alerta/LEMC da disciplina de Infectologia da UNIFESP

^IIIBiomédica; Laboratório Alerta/LEMC da disciplina de Infectologia da UNIFESP

^IVProfessora afiliada do Departamento de Medicina da UNIFESP; diretora do Laboratório Central do Hospital São Paulo da UNIFESP

^VBióloga; diretora da Divisão de Microbiologia Brasil da Thermo Fisher Scientific, São Paulo

^VIProfessora adjunta do Departamento de Medicina da UNIFESP; Laboratório Alerta/LEMC da disciplina de Infectologia da UNIFESP; pesquisadora do Conselho Nacional de Ciência e Desenvolvimento Tecnológico (CNPq), Ministério da Ciência e Tecnologia (Processo n. 307816/2009-5)

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

INTRODUÇÃO: As fitas Oxoid^® M.I.C.Evaluator^® (M.I.C.E., Thermo Fisher Scientific, Basingstoke, UK), recém-lançadas no mercado brasileiro, representam uma alternativa rápida para a realização de testes de sensibilidade a antimicrobianos (TSA).

OBJETIVO: Avaliar o desempenho da metodologia M.I.C.E. em relação à microdiluição em caldo (teste de referência) e ao Etest^® (BioMérieux, Marcy l'Étoile, France). Material e métodos: Foram selecionados 160 isolados bacterianos, sendo P. aeruginosa (20), Acinetobacter spp. (20), K. pneumoniae (20), E. coli (20), S. aureus (20), Staphylococcus coagulase-negativa (20), E. faecalis (20) e E. faecium (20). Os TSAs foram realizados por microdiluição em caldo, Etest e M.I.C.E., seguindo-se as recomendações do Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI, 2009) e dos respectivos fabricantes. Os resultados foram interpretados segundo os critérios estabelecidos pelo CLSI e comparados por análise de regressão.

RESULTADOS: Avaliando-se todas as combinações de antimicrobianos vs. a espécie bacteriana, o desempenho da metodologia M.I.C.E. foi muito bom, apresentando uma concordância geral (variação na concentração inibitória mínima [CIM] ± 1-log₂) > 90%, exceto para cefotaxima (85%) e vancomicina (76,3%), quando em comparação com os resultados da metodologia de referência. Quando comparado com o Etest, a metodologia M.I.C.E. apresentou concordância geral > 96%, com exceção para a combinação amoxicilina/ácido clavulânico (67,5%).

CONCLUSÃO: Os resultados do TSA obtidos pela metodologia M.I.C.E. apresentaram boa correlação com aqueles obtidos pela microdiluição em caldo e pelo Etest, indicando que essa metodologia é uma alternativa rápida para a determinação da CIM pelos laboratórios de microbiologia clínica. Atenção especial deve ser dada á determinação da CIM para a combinação amoxicilina/ácido clavulânico.

Unitermos: Concentração inibitória mínima, Antimicrobianos, Teste de sensibilidade a antimicrobianos, Etest M.I.C.E.

ABSTRACT

INTRODUCTION: The Oxoid^® M.I.C.Evaluator^TM methodology (M.I.C.E., Thermo Fisher Scientific, Basingstoke, UK), recently released into the market, represents a rapid alternative to antimicrobial susceptibility testing.

OBJECTIVE: The objective of this study was to evaluate the performance of M.I.C.E. methodology in relation to broth microdilution (reference test) and Etest^® (BioMérieux, Marcy l'Étoile, France). Material and method: A total of 160 bacterial isolates were collected comprising the following species: P. aeruginosa (20), Acinetobacter spp. (20), K. pneumoniae (20), E. coli (20), S. aureus (20), coagulase-negative Staphylococcus (20), E. faecalis (20) and E. faecium (20). Following Clinical Laboratory Standands Institute (CLSI) standards (2009) and the manufacturers' recommendations, antimicrobial susceptibility testing was performed using broth microdilution method, Etest and M.I.C.E. The results were interpreted according to the criteria established by CLSI and compared through regression analysis.

RESULTS: All antimicrobial combinations vs. bacterial species were evaluated and M.I.C.E. methodology yielded good results with general correlation (MIC variation ± 1-log₂) > 90%, except for cefotaxime (85%) and vancomycin (76.3%) when compared with the reference method. The M.I.C.E. results compared to Etest showed general correlation (> 96%), except for amoxicillin/clavulanic acid (67.5%) combination.

CONCLUSION: AST results obtained from M.I.C.E. methodology showed a good correlation with those from broth microdilution and Etest, which corroborates its time effectiveness in the determination of MIC. However, the combination of amoxicillin/clavulanic acid requires further attention.

key words: Minimal inhibitory concentration, Antimicrobial, Antimicrobial susceptibility testing, Etest M.I.C.E.

Introdução

A determinação do perfil de sensibilidade aos antimicrobianos, o antibiograma, é uma das principais atividades realizadas por laboratórios de microbiologia clínica. Os resultados desses testes auxiliam na seleção da terapia antimicrobiana mais adequada. Para a determinação do perfil de sensibilidade, várias metodologias estão disponíveis, porém aquelas consideradas padrão-ouro, como a diluição em ágar e a microdiluição em caldo, são laboriosas para serem executadas por um laboratório de rotina, embora forneçam resultados quantitativos (concentração inibitória mínima [CIM]). Por outro lado, técnicas qualitativas, como a disco difusão, apesar de serem de fácil execução não são capazes de predizer a CIM.

Para o tratamento de infecções leves, a determinação da CIM nem sempre é necessária. No entanto, para o tratamento de infecções graves, principalmente as que acometem pacientes em unidades de terapia intensiva (UTIs), a determinação da CIM auxilia não somente na seleção da terapia antimicrobiana, mas orienta o esquema posológico mais adequado. A determinação da CIM também é necessária para microrganismos ou combinações de microrganismos/antimicrobianos, em que o teste de disco difusão não é confiável, por exemplo, para glicopeptídeos e S. aureus⁽¹⁰⁾. Dessa maneira, metodologias de fácil execução que forneçam a CIM com acurácia são altamente desejáveis.

A metodologia de gradiente preestabelecido de antimicrobianos em uma fita plástica, como o Etest^® (BioMérieux, Marcy l'Étoile, France), é conveniente na rotina laboratorial por ser versátil e apresentar boa concordância com as metodologias de referência^{(1, 2, 11)}. Recém-lançadas no mercado brasileiro, as fitas Oxoid^® M.I.C.Evaluator^® (M.I.C.E., Thermo Fisher Scientific, Basingstoke, UK), representam uma alternativa para a determinação da CIM em teste de sensibilidade a antimicrobianos (TSA).

Este estudo teve como objetivo avaliar comparativamente o desempenho das fitas M.I.C.E. em relação ao teste de referência empregado, microdiluição em caldo, e ao Etest.

Material e métodos

Amostras bacterianas

Foram selecionados aleatoriamente 160 isolados bacterianos, sendo 20 isolados de cada uma das seguintes espécies: Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter spp., Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Staphylococcus coagulase-negativa, Enterococcus faecalis e Enterococcus faecium. Essas amostras foram coletadas nos últimos cinco anos de pacientes internados no Hospital São Paulo e estavam armazenadas no banco de microrganismos do Laboratório Especial de Microbiologia Clínica (LEMC). Apenas uma amostra por paciente foi incluída no estudo. A identificação bacteriana foi realizada pelo Laboratório de Microbiologia do Hospital São Paulo, conforme os métodos de identificação bacteriana empregados rotineiramente. As amostras foram subcultivadas por duas vezes em ágar sangue antes da realização dos TSAs para garantir que os isolados bacterianos não apresentavam contaminação e estavam metabolicamente ativos.

Teste de sensibilidade a antimicrobianos

Os TSAs foram realizados pela metodologia de microdiluição em caldo, considerada a técnica padrão-ouro, e por meio das fitas de gradiente antimicrobiano Etest (BioMérieux, Marcy l'Étoile, France) e M.I.C.E. (Thermo Fisher Scientific, Basingstoke, UK), segundo a recomendação do Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI)⁽³⁾ e dos fabricantes, respectivamente.

As seguintes combinações de patógenos e antimicrobianos foram avaliadas: P. aeruginosa e Acinetobacter spp. (grupo não fermentadores; gentamicina, ciprofloxacina e imipenem); K. pneumoniae e E. coli (grupo Enterobacteriaceae; ampicilina, amoxacilina/clavulanato, gentamicina, ciprofloxacina, cefotaxima e imipenem); S. aureus e SCN (grupo estafilococos; ciprofloxacina, eritromicina, gentamicina, oxacilina, linezolida e vancomicina); E. faecalis e E. faecium (grupo enterococos; ampicilina, gentamicina high level [HL], linezolida e vancomicina). A interpretação da CIM foi realizada, independentemente, por três observadores para a confirmação dos resultados. Para o controle de qualidade dos testes de sensibilidade, utilizaram-se as amostras da American Type Culture Collection (ATCC^®): E. coli ATCC^® 25922, P. aeruginosa ATCC^® 27853, S. aureus ATCC^® 29213 e E. faecium ATCC^® 29212.

Para as três metodologias, o inóculo bacteriano foi preparado em caldo Müeller-Hinton (MH) e a turbidez ajustada a 0,5 da escala de McFarland (1,5×10⁸ UFC/ml), utilizando o turbidímetro digital (Baxter^®, Sacramento, EUA).

A mesma suspensão do inóculo bacteriano foi semeada em placa de ágar MH e em até 15 minutos após sua preparação e as fitas Etest ou M.I.C.E., contendo os antimicrobianos especificados anteriormente, foram dispensados sobre a placa. As placas foram incubadas a 35ºC por um período de 16-24 horas em aerobiose. A leitura da CIM foi determinada como a concentração de antimicrobiano correspondente à intersecção entre a fita de Etest ou M.I.C.E. e a área de crescimento bacteriano. Para agentes bacteriostáticos, como a linezolida, a CIM, pelas metodologias Etest e M.I.C.E., foi determinada como a concentração que inibiu 90% e 80% do crescimento bacteriano, respectivamente. As CIMs foram ajustadas à escala logarítmica na base 2. Na Figura podemos observar o teste de sensibilidade para quatro isolados bacterianos pelas metodologias Etest e M.I.C.E..

Resumidamente, as placas de microdiluição em caldo foram confeccionadas manualmente, utilizando-se o sal dos antimicrobianos relacionados anteriormente diluídos em água milli-Q e conservados em freezer a -70ºC até o momento da utilização. Após serem inoculadas, as placas foram incubadas a 35ºC, em ar ambiente, por 16-24 horas. As CIMs para cada amostra foram determinadas após o período de incubação mediante a leitura visual das placas. A CIM foi definida como a menor concentração de antimicrobiano capaz de inibir o crescimento bacteriano. As amostras foram classificadas em sensíveis ou resistentes, empregando-se os limites de sensibilidade preconizados pelo CLSI⁽⁴⁾.

Análise estatística

Os resultados das CIMs obtidas pelas técnicas de microdiluição em caldo, Etest e M.I.C.E. foram comparados por análise de regressão. A concordância geral foi definida quando o resultado da CIM obtida pelo Etest ou M.I.C.E. variou ± 1-log₂ diluição da CIM obtida pela microdiluição em caldo. O resultado foi considerado discordante quando houve diferença > 2-log₂ diluições entre os resultados. Os resultados também foram interpretados em relação à concordância da categoria de sensibilidade. Eles foram considerados concordantes quando as CIMs obtidas pelas diferentes metodologias encontravam-se em uma mesma categoria de sensibilidade estabelecida pelo CLSI. Além disso, as taxas de erros leves, graves e muito graves também foram calculadas segundo os critérios do CLSI⁽⁷⁾. Foram definidas como erro leve a mudança da categoria sensível ou resistente para a intermediária ou desta para a sensível ou resistente entre as metodologias de referência e avaliada; erro grave, a mudança da categoria sensível pela metodologia de referência para resistente pela metodologia testada (falsa-resistência pela metodologia teste); e erro muito grave, a mudança da categoria de resistente pela metodologia de referência para a sensível pela metodologia testada (falsa-sensibilidade pela metodologia teste). Foram consideradas aceitáveis taxas de até 1,5% para erros muito graves, 3% para erros graves e 10% para erros leves⁽⁴⁾. Os resultados obtidos pela metodologia M.I.C.E. também foram comparados com os obtidos pelo Etest. Todas as análises foram realizadas com auxílio do programa SPSS^® for Windows, versão 17.0 (IBM Corporation^®, Nova York, EUA, 2008).

Resultados

Desempenho das fitas M.I.C.E. e Etest em relação ao teste de referência, microdiluição em caldo

Um total de 160 isolados clínicos e 11 antimicrobianos diferentes foram testados, compondo 38 combinações de antimicrobianos/microrganismos (Tabela 1).

As taxas de concordância geral por categoria e os erros apresentados pela metodologia M.I.C.E. em relação ao teste de referência podem ser observadas na Tabela 2. De maneira geral, a concordância geral, considerando-se a variação de ± 1-log₂, foi de 93,7% e a concordância categórica, 94,6%. Todos os antimicrobianos obtiveram concordância geral > 90% entre essas metodologias, com exceção da cefotaxima (85%) e da vancomicina (76,3%). Apesar de esses dois antimicrobianos apresentarem resultados de concordância geral < 90%, as porcentagens de erros foram consideradas nos limites aceitáveis.

A concordância entre as categorias de sensibilidade foi excelente para todos os antimicrobianos, exceto para a combinação de amoxicilina-clavulanato, que foi de apenas 62,5%. Foi observada uma tendência a CIMs mais elevadas pela metodologia M.I.C.E. Taxas superiores àquelas consideradas aceitáveis para erros leves (30%) e erros graves (7,5%) foram constatadas para essa combinação, porém, não houve a detecção de erros muito graves.

Da mesma maneira, os resultados obtidos pela metodologia Etest apresentaram excelente correlação com a microdiluição em caldo para todos os antimicrobianos testados, exceto para cefotaxima (82,5%) e vancomicina (88,8%) (Tabela 3) . A concordância entre categorias para a combinação de amoxicilina-clavulanato foi de apenas 77,5%, semelhante aos resultados do M.I.C.E., porém com resultados apresentando tendência a valores inferiores aos da metodologia de referência.

Desempenho das fitas M.I.C.E. em relação ao Etest

A avaliação geral dos testes das fitas de sensibilidade M.I.C.E. e Etest em relação ao teste de referência pode ser observada na Tabela 4. A concordância geral entre as fitas Etest e M.I.C.E., considerando a variação de ± 1-log₂, foi de 96,7% e a concordância de categorias, 95,1% (Tabela 5). No entanto, para a combinação amoxicilina-clavulanato, obtivemos apenas 67,5% de concordância geral, 40% de erros leves e 15% de erros graves, o que gerou uma concordância de categorias de apenas 45%.

Discussão

Em geral, todos os antimicrobianos obtiveram uma concordância geral > 90% para a fita M.I.C.E. em relação ao teste de referência, com exceção da cefotaxima e da vancomicina. A baixa taxa de concordância (76,3%) para vancomicina provavelmente é decorrente das diferenças na detecção da CIM desse agente antimicrobiano pelas técnicas baseadas na difusão em ágar e microdiluição em caldo. Estudos anteriores reportaram que as CIMs para vancomicina obtidas por técnicas de difusão ou diluição em ágar apresentaram CIMs superiores àquelas determinadas pela técnica de microdiluição em caldo^{(5, 8, 9)}.

A concordância geral entre a metodologia M.I.C.E. e a microdiluição em caldo, método de referência, foi muito boa (93,7%) e semelhante àquela obtida pelo Etest (96,1%). Esses índices foram superiores aos observados por Mushtaq et al. (> 88% para M.I.C.E. e > 86% para Etest)⁽⁶⁾. Os autores relataram também taxas semelhantes de concordância geral para cefotaxima (89,9%) diante do grupo Enterobacteriaceae, mas não para a combinação vancomicina/cocos Gram-positivos. Essa diferença poderia ser explicada pelo método de referência distinto utilizado em nosso estudo (ágar diluição vs. microdiluição em caldo)^{(5, 9)}. No mesmo trabalho, Mushtaq et al. relataram uma fraca correlação entre as fitas de imipenem diante do grupo Enterobacteriaceae (81,7% e 82,5% para M.I.C.E. e Etest, respectivamente). Em contrapartida, nossos resultados mostraram excelente desempenho dessas fitas (97,5% e 100% para M.I.C.E. e Etest, respectivamente). Esses resultados discrepantes podem ser explicados pelas diferentes espécies de enterobactérias testadas por cada um dos estudos. Mushtaq et al. incluíram espécies de Citrobacter spp., Enterobacter spp., Proteus spp. e Salmonella spp., além de espécies de E. coli e Klebsiella spp. Segundo os autores, a baixa concordância para imipenem nesse grupo poderia ser explicada pela subjetividade na leitura das CIMs em espécies de Proteus, devido à formação de "véu".

A metodologia M.I.C.E. apresentou valores aceitáveis para erros leves e graves, de acordo com os limites estabelecidos pelo CLSI, exceto para a combinação amoxicilina-clavulanato. Observamos uma tendência a valores maiores de CIM para essa combinação quando a metodologia M.I.C.E. foi empregada, tanto para isolados de K. pneumoniae como de E. coli. Essa tendência também foi relatada por Mushtaq et al. (78,3% de concordância geral para Enterobacteriaceae)⁽⁶⁾. Esse fato pode ser decorrente das características dos isolados clínicos testados ou pode estar relacionado com a estabilidade do clavulanato na fita ou seu armazenamento (2-8ºC). Dessa maneira, novos estudos devem ser realizados com maior número de amostras bacterianas para a confirmação desses resultados. Erros muito graves não foram observados por nosso estudo.

As técnicas de M.I.C.E. e Etest apresentaram concordância excelente com a técnica de referência para todos os antimicrobianos avaliados, com exceção da combinação amoxicilina-clavulanato (67,5%), assim como reportado por Mushtaq et al. (70,6%)⁽⁶⁾.

Conclusão

À medida que novos métodos para a avaliação da sensibilidade a antimicrobianos tornam-se disponíveis comercialmente, é importante estabelecer seu desempenho em comparação com os métodos de referência, microdiluição em caldo e diluição em ágar. A fita M.I.C.E. foi desenvolvida como uma alternativa para a determinação da CIM, e os resultados obtidos neste estudo demonstraram excelente correlação com a microdiluição em caldo para a maioria dos antimicrobianos testados.

Os dados obtidos indicaram que ambas as fitas (M.I.C.E. e Etest) apresentaram resultados equivalentes entre si e boa acurácia quando comparadas à técnica de microdiluição em caldo recomendada pelo CLSI. É importante salientar que, para a metodologia M.I.C.E., a combinação amoxicilina-clavulanato apresentou tendência a valores de CIM superiores àqueles determinados pelo teste de referência, ao contrário do Etest, em que os resultados apresentaram-se inferiores ao teste de referência.

Portanto, a técnica M.I.C.E. constitui uma excelente opção para a determinação da CIM pelos laboratórios de microbiologia clínica. A leitura da CIM é facilitada pela alternância de cores na fita, sendo que sua apresentação individual e sua estocagem a 2-8ºC são fatores que contribuem para seu fácil manejo na rotina laboratorial.

Agradecimentos

À equipe do Laboratório Central do Hospital São Paulo da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP).

Primeira submissão em 02/02/11

Última submissão em 02/02/11

Aceito para publicação em 02/03/11

Publicado em 20/04/11

Este estudo foi parcialmente financiado pela Thermo Fisher Científica, Divisão de Microbiologia Brasil, São Paulo, Brasil.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  01 Jun 2011
• Data do Fascículo
  Abr 2011

Histórico

• Recebido
  02 Fev 2011
• Revisado
  02 Fev 2011