Caracterização molecular e divergência genética de Bemisia tabaci (Genn.) (Hemiptera: Aleyrodidae) em diferentes culturas e locais de cultivo

Molecular characterization and genetic divergence of Bemisia tabaci (Genn.) (Hemiptera: Aleyrodidae) on different crops and growing areas

Silverleaf whitefly; RAPD-PCR; biotype; genetic diversity; squash silvering

SYSTEMATICS, MORPHOLOGY AND PHYSIOLOGY

Caracterização molecular e divergência genética de Bemisia tabaci (Genn.) (Hemiptera: Aleyrodidae) em diferentes culturas e locais de cultivo

Molecular characterization and genetic divergence of Bemisia tabaci (Genn.) (Hemiptera: Aleyrodidae) on different crops and growing areas

Fernanda Von H M Fontes^I; Carlos A Colombo^II; André L Lourenção^I

^ICentro de Fitossanidade. Instituto Agronômico (IAC), CP 28, 13001-970 Campinas, SP, Brasil; [e-mail]; [e-mail]

^IICentro de Genética. Instituto Agronômico (IAC), CP 28, 13001-970 Campinas, SP, Brasil; [e-mail]

ABSTRACT

Knowledge on the genetic variation of populations of Bemisia tabaci (Genn.) can improve the understanding of genetic diversity found in their biotypes and, consequently, offer guidelines for its management. In this study, the molecular characterization was performed and genetic diversity data were obtained for this insect from three regions of Brazil on different crops [cotton and soybean (Mato Grosso - MT); cabbage (Distrito Federal - DF); soybean and potato (São Paulo - SP)], using RAPD markers. RAPD analysis indicated 80.6% polymorphic loci and the average genetic similarity obtained by the Jaccard coefficient was 0.67. The whitefly populations collected on potato (SP) and soybean (MT) had higher genetic diversity values (0.75 and 0.72, respectively). Shannon's index (Ho) showed higher values for potato and soybean (SP e MT), and a smaller value for cabbage (DF). A high genetic divergence within and among the collected populations occurred, structured according to the regions of collection. Moreover, the great genetic similarity observed between potato (SP) and soybean (SP) populations suggested that both belong to the same biotype B and reinforces the polyphagous behavior of the species.

Key words: Silverleaf whitefly, RAPD-PCR, biotype, genetic diversity, squash silvering

No Brasil, o primeiro relato de Bemisia tabaci (Genn.) data da década de 20, na Bahia, sendo citada a ocorrência do inseto em baixos níveis de infestação (Bondar 1928). Décadas mais tarde, ocorreram surtos populacionais no Norte do Paraná e na região de Ourinhos (SP) (Costa et al 1973). Após essas constatações, surtos populacionais de mosca-branca no Brasil deram-se apenas no início dos anos 90 em plantas ornamentais e em lavouras de tomate e abóbora, no estado de São Paulo. De acordo com Lourenção & Nagai (1994), os insetos ocorrendo nessas culturas pertenciam ao biótipo B, que se caracteriza, entre outros fatores, por possuir maior quantidade de plantas hospedeiras, resistência a diversos inseticidas e capacidade de induzir desordens fisiológicas a certos tipos de hospedeiros, como o prateamento da folha da aboboreira e o amadurecimento irregular dos frutos do tomateiro (Costa & Brown 1991, Brown 2000). Posteriormente, a praga disseminou-se pelas principais áreas agrícolas do país (Haji et al 1996, França et al 1996), e há relatos da sua ocorrência em muitos estados brasileiros, levando a perdas estimadas que atingem até 100% em algumas culturas e cujos prejuízos somam alguns bilhões de dólares (Ferreira & Avidos 1998).

As espécies de mosca-branca são identificadas pela taxonomia convencional ou clássica, a qual tem se mostrado ineficaz para a separação dos diferentes biótipos reconhecidos para esse inseto, uma vez que dentro do complexo B. tabaci as estruturas morfológicas são muito semelhantes. Técnicas moleculares têm sido desenvolvidas e utilizadas no mundo todo, facilitando a separação dos biótipos de forma rápida e segura. Atualmente, há registros de mais de 24 biótipos no mundo, sendo que essa grande variabilidade sugere que B. tabaci seja um complexo de espécies ou de biótipos (Brown et al 1995, Frohlich et al 1999, Perring 2001) que podem ser identificados pelo uso de izoenzimas, reações específicas de fitotoxicidade e marcadores moleculares (Perring 2001).

A correta identificação de biótipos de B. tabaci é de suma importância para seu manejo adequado, uma vez que dentre os vários biótipos já caracterizados, há aqueles que têm maior importância agrícola, como o B e o Q (Simón et al 2007), e que podem apresentar diferenças na resistência aos inseticidas normalmente usados para seu controle (Horowitz et al 2003).

Os marcadores moleculares permitem gerar uma grande quantidade de informações sobre diversidade genética e relações filogenéticas dos indivíduos analisados, sendo que o grande número disponível destes marcadores permite uma amostragem extensiva dos genomas de interesse em nível de DNA, sem influência do ambiente (Ferreira & Grattapaglia 1996). Por essas razões, estão sendo muito utilizados no reconhecimento de biótipos da mosca-branca B. tabaci, que pode ser realizado por meio das técnicas de RAPD, AFLP, SSR e polimorfismo de DNA mitocondrial e ribossômico (Guirao et al 1997, Cervera et al 2000, De Barro et al 2000, De Barro 2005). As análises feitas por RAPD têm se mostrado eficazes no reconhecimento de variabilidade dentro do complexo B. tabaci, a exemplo do trabalho desenvolvido por Lima et al (2002), que caracterizaram diferentes populações brasileiras de mosca-branca por meio desse marcador molecular. Além disso, é um método que requer pequena quantidade de DNA proveniente de material que pode ser preservado em álcool, tem baixo custo e é relativamente simples e rápido, além de ser possível utilizar cada indivíduo em qualquer estágio de desenvolvimento (Perring et al 1993, Abdullahi et al 2003).

Para Gerling (2002), tanto a distribuição geográfica quanto o uso de diferentes plantas hospedeiras podem levar ao surgimento de diferenças alopátricas. Fatores genéticos como arrenotoquia e as atividades humanas que proporcionam grande quantidade de alimentação homogênea e estável (monoculturas, muito disseminadas no Brasil), em associação com a pressão de seleção do ambiente pelo uso indiscriminado de inseticidas, podem contribuir para a rápida especialização e posterior especiação em moscas-brancas. O conhecimento sobre a variação genética entre as populações de mosca-branca é, portanto, de grande interesse para o controle e manejo mais eficientes (Lima et al 2002).

Em batata (Solanum tuberosum), a ocorrência de mosca-branca é conhecida há vários anos, mas suas populações sempre foram pequenas, não causando graves danos às plantas (Mound & Halsey 1978, Gallo et al 2002). Altas infestações do biótipo B de B. tabaci em lavouras de batata são recentes, tendo sido constatados os primeiros surtos populacionais apenas a partir de 2001 (Lourenção et al 2003).

No presente trabalho, os objetivos foram obter a caracterização molecular de populações de B. tabaci que vêm ocorrendo em diferentes culturas, especialmente a batata, consideradas suspeitas de diferirem do biótipo B, e analisar a diversidade genética intra e interpopulacional dos materiais coletados, por meio da técnica de RAPD-PCR.

Material e Métodos

Moscas-brancas utilizadas. O material de estudo foi representado por 60 insetos adultos coletados em diversas culturas e locais (Tabela 1). Os insetos coletados foram armazenados em etanol a 92% e mantidos a 4ºC até sua utilização.

Teste de prateamento da folha de aboboreira. Para as moscas-brancas de Campinas (SSP), foi realizado um teste de prateamento da folha de aboboreira para confirmar se a população pode ser o biótipo B, uma vez que esse biótipo induz essa desordem fisiológica (Brown et al 1995), causada pela introdução de substâncias tóxicas pelas ninfas da mosca-branca (Byrne & Bellows 1991). Para tanto, a infestação foi feita com a liberação de adultos do inseto criados em soja, em dois vasos contendo, cada um, uma muda de aboboreira (Cucurbita pepo cv. Styria) com a primeira folha verdadeira completamente desenvolvida. A planta foi coberta por gaiola plástica, com tampa telada, para evitar a fuga dos insetos. Um terceiro vaso, contendo muda de aboboreira, foi mantido protegido também por gaiola, sem infestação por B. tabaci, servindo como controle.

Obtenção do DNA total. Amostras representadas por um indivíduo adulto foram colocadas em microtubos de 1,5 ml, maceradas em 60 µl de tampão de lise (Tris-HCl 10 mM pH 8,0, EDTA 1 mM, Triton X-100 0,3%, proteinase K 60 µg/ml) e incubados a 65ºC por 15 min. O homogeneizado foi incubado a 95ºC por 7 min (para a inativação da proteinase K) e congelado imediatamente a -20ºC (Lima et al 2002).

RAPD-PCR. Para a obtenção do perfil de amplificação de RAPD, foram realizadas reações de amplificação em volume total de 15 µl, com as seguintes concentrações de reagentes: 1x Buffer PCR; 1,5 mM MgCl2; 200 µM dNTP; 1U Taq DNA polimerase, 0,4 µM do iniciador (Tabela 2) e 10 a 15 ng de DNA (aproximadamente 4 µl). A amplificação foi feita no mesmo termociclador, modelo PTC-200 (MJ Research), programado para um ciclo de 3 min a 94ºC, 45 ciclos de 1 min a 93ºC, 1 min a 35ºC, 2 min a 72ºC e um ciclo final de extensão de 5 min a 72ºC. Em continuidade, os produtos da PCR foram mantidos congelados a -20ºC até sua análise por eletroforese em gel de agarose 1,8% em tampão tris-borato-EDTA (TBE). A coloração do gel foi feita com brometo de etídio e os produtos de amplificação visualizados e fotografados contra luz UV. Foi incluído um controle negativo sem DNA em todas as reações.

Análise dos dados. Os produtos amplificados (bandas) foram codificados como presentes (1) ou ausentes (0) para cada indivíduo analisado e os dados apresentados em uma matriz de dupla entrada (indivíduos vs. bandas). A partir dessa matriz, foi calculado um índice de similaridade genética entre todos os indivíduos, comparados dois a dois (Sij), utilizando-se o índice de concordância de Jaccard (Sneath & Sokal 1973).

A diversidade genética inter e intrapopulacional das amostras procedentes das diferentes culturas e locais de coleta foi estimada pelo índice de Shannon (Ho). Esse índice foi assim obtido (Lyn & Schall 1989): Ho = -Σpi log pi, onde pi é a frequência fenotípica do marcador. Também foi realizada a análise de variância dos dados moleculares (AMOVA) (Excoffier et al 1992), que revela a partição da variação genética total entre e dentro das populações de estudo, utilizando o software Arlequin versão 3.1.

A medida de parentesco entre os indivíduos foi baseada em análise multivariada e a partir do índice de similaridade (Jaccard) obtido entre os indivíduos. Dessa forma, a partir dos dados da matriz de similaridade, foi calculado um dendrograma pelo método UPGMA de classificação hierárquica (Método da Média Aritmética não Ponderada). A estabilidade dos agrupamentos foi testada através de 10.000 reamostragens de bootstrap.

Resultados

Teste de prateamento da folha de aboboreira. As plantas submetidas à infestação apresentaram os sintomas de prateamento das folhas. Portanto, para as análises moleculares, a população proveniente da cultura de soja do IAC serviu de referência como biótipo B. Essa população vem sendo mantida há vários anos pelo Centro de Fitossanidade do IAC e foi inicialmente identificada pela Dra. Judith K. Brown, Universidade do Arizona, EUA, como pertencente a esse biótipo.

RAPD-PCR. As amplificações RAPD foram feitas com 13 iniciadores e produziram o total de 71 loci, dos quais 80,6% apresentaram-se polimórficos, sendo 4,5 o número médio de bandas polimórficas (Tabela 2). O tamanho das bandas amplificadas variou de 300 pb a 1300 pb. Os iniciadores que forneceram maior e menor número de loci totais e polimórficos foram OPO 01 e OPAC 06, com sete bandas totais e polimórficas, e OPH-18, sendo que, das três bandas totais amplificadas, duas apresentaram polimorfismo de presença e ausência.

A matriz de dados binários foi base para o cálculo do índice de similaridade genética (Jaccard) entre todos os 60 indivíduos do estudo. O valor médio de similaridade encontrado entre todas as comparações foi de 0,67, inferior ao encontrado por Lima et al (2002) que, entre 109 indivíduos de biótipo B, obtiveram similaridade média de 0,73, utilizando cinco iniciadores de RAPD. O maior valor de similaridade encontrado foi entre dois indivíduos da população AMT (0,95) e o menor valor (0,31) entre indivíduos BSP e SMT, que também se distanciaram no dendrograma de populações, clusterizando-se em clados diferentes.

Os menores valores médios de similaridade encontrados dentro de populações foram em soja (SMT) e batata (BSP), com 0,72 e 0,75, respectivamente, enquanto os maiores foram obtidos para as populações de soja do estado de São Paulo (SSP), algodão (AMT) e repolho (RDF), com valores de 0,76, 0,80 e 0,84, respectivamente.

A relação de similaridade genética revelada pelo índice de Jaccard entre os indivíduos do estudo permitiu a construção de um dendrograma (UPGMA) (Fig 1), que mostrou a estruturação da diversidade genética presente nos indivíduos em basicamente dois grandes grupos. O grupo 1 (G1) congregou a maioria dos indivíduos das populações BSP e SSP, enquanto o grupo 2 (G2) os indivíduos das populações SMT, AMT e RDF, o grupo 3 (G3) os de três indivíduos BSP e o grupo 4 (G4) apenas um indivíduo AMT.

A partir dos dados do índice de similaridade de Jaccard obtido para todos os indivíduos, foi calculada a média desses valores dentro e entre populações. A média foi utilizada para a construção de um novo dendrograma (Fig 2), onde a estrutura genética formada é explicada, principalmente, pelos locais de procedência das amostras do estudo.

O resultado da AMOVA revelou que uma porção considerável da variação genética encontra-se entre as populações (21%) e que a maior porcentagem de variação observada no material de estudo ocorre dentro das próprias populações (79%).

O índice de diversidade de Shannon (Ho), que diz respeito à variabilidade intrapopulacional, foi calculado levando-se em conta a frequência fenotípica do marcador. O índice evidenciou a maior taxa de divergência genética entre os insetos presentes nas populações SMT, SSP e BSP, cujos valores encontrados foram de 7,48; 7,37 e 7,26, respectivamente. AMT e RDF apresentaram os menores valores de Ho (6,56 e 5,63, respectivamente), ou seja, os menores índices de divergência genética dentro de suas populações. Os resultados da matriz de similaridade corroboram os dados de Shannon (Ho), onde as três populações com maiores valores de Ho possuem os menores valores de similaridade de Jaccard.

Discussão

Os resultados aqui obtidos demonstraram a variabilidade intra e interpopulacional existente em B. tabaci nas regiões e culturas amostradas neste estudo, à semelhança do observado por outros autores (Lima et al 2002). Uma das hipóteses para entender a estrutura genética baseada nas regiões geográficas de coleta pode ser atribuída ao hábito migratório do inseto, que, por sua vez, é consequência de fatores como a deterioração da cultura atacada e/ou a direção do vento, o que os faz migrar para outros campos de cultivos (Villas Bôas et al 1997). Segundo Byrne (1999), o maior relato de voo a longa distância por B. tabaci foi de 7 km, de maneira passiva, numa corrente de ar. Voos desse tipo facilitam a migração de populações para locais distantes e a consequente colonização de várias outras culturas; assim, pode ocorrer fluxo gênico entre as populações, mesmo que elas não estejam tão próximas entre si. Esse parece ser o caso de AMT/SMT e RDF. Apesar da distância existente entre Rondonópolis e Distrito Federal, a facilidade de migração do inseto entre os dois locais provavelmente é maior que do que entre eles e Campinas, uma vez que a região Centro-Oeste é de geografia plana, sem obstáculos que possam inibir tal migração. Isso não ocorre em direção ao estado de São Paulo, pois a Serra da Mantiqueira pode servir de barreira, atuando como fator de divisão dessas populações. Outras explicações para essa clusterização heterogênea podem ser as diferenças entre fatores nutricionais e comportamentais (Lima et al 2002) ou o modo de introdução do biótipo B, que pode ter se dado de forma dispersa, e não por uma única população fundadora (Lourenção & Nagai 1994).

Mesmo com a possível ocorrência de migração entre insetos de culturas e regiões próximas, assim como discutido anteriormente, a similaridade média intrapopulacional encontrada foi mais elevada do que a média geral. De acordo com De Barro (2005), isso pode ser devido ao aumento de endocruzamentos na população, o que pode levar à diminuição da variabilidade genética, gerando indivíduos geneticamente mais parecidos.

Um dos objetivos do estudo foi caracterizar insetos de B. tabaci ocorrendo em lavouras antes não atacadas, como a cultura da batata, com suspeita de não pertencerem ao biótipo B. Os indivíduos coletados na cultura da batata, no município de Monte Mor (SP), foram em grande parte agrupados com a população SSP. Em outras palavras, a população BSP é geneticamente próxima de SSP e, nesse caso, seria mais provável supor que os insetos que ocorrem na cultura da batata seriam procedentes da cultura da soja. Considerando que a ocorrência da mosca-branca na cultura da batata é relativamente recente, era de se esperar menor divergência genética entre os insetos dessa cultura, o que não ocorreu. Por outro lado, a evidência de alta divergência genética na população BSP poderia ser explicada pela ausência de estrutura genética na população de B. tabaci ocorrendo na cultura da soja do estado de São Paulo. Nesse caso, os indivíduos da cultura da soja que, eventualmente, teriam migrado para a cultura da batata, teriam diversidade alélica relativamente alta em relação à população original.

A grande similaridade genética entre BSP e SSP, observada tanto no dendrograma com todos os indivíduos quanto no de populações, enfraquece a hipótese de que B. tabaci em batata possa representar um novo biótipo, dado que sua presença nessa cultura, nos níveis atuais de infestação, é relativamente recente. Além disso, como SSP pertence ao biótipo B, como confirmado pelo teste de prateamento, é mais provável que os insetos da população BSP pertençam ao mesmo biótipo. Porém, estudos abrangendo culturas de batata de outras regiões do Brasil, com maiores amostragens populacionais e outros tipos de marcadores moleculares e testes de prateamento, poderiam elucidar melhor a questão.

Como principais inferências, destacam-se alguns aspectos sobre o estudo genético das populações de B. tabaci: existe importante divergência genética entre as populações coletadas e dentro delas; a estruturação da diversidade deu-se em função das regiões de coleta (Sudeste e Centro-Oeste); e, por fim, a grande similaridade genética observada entre BSP e SSP sugere que ambas as populações sejam pertencentes ao biótipo B e reforça o comportamento polífago do inseto.

Agradecimentos

À Dra. Geni Litvin Villas Bôas, pelo fornecimento das moscas-brancas do Distrito Federal, à Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pela bolsa concedida ao primeiro autor e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela bolsa de produtividade em pesquisa concedida ao terceiro autor.

Received 13/X/08.

Accepted 04/I/10.

Edited by Fernando L Cônsoli - ESALQ/USP

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  14 Maio 2010
• Data do Fascículo
  Abr 2010

Histórico

• Recebido
  13 Out 2008
• Aceito
  04 Jan 2010