Variabilidade Genética em Populações de Aedes aegypti (L.) (Diptera: Culicidae) Utilizando Marcadores de RAPD

Genetic Variability in Aedes aegypti (L.) (Diptera: Culicidae) Populations Using RAPD Markers

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Variabilidade Genética em Populações de Aedes aegypti (L.) (Diptera: Culicidae) Utilizando Marcadores de RAPD

Genetic Variability in Aedes aegypti (L.) (Diptera: Culicidae) Populations Using RAPD Markers

Cassia Hiragi^I; Kenya Simões^I; Erica Martins^II; Paulo Queiroz^II; Luzia Lima^II; Rose Monnerat^II

^IUniv. de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Depto. de Genética e Morfologia, Lab. de Genética, Asa Norte, 70910-900, Brasilia, DF; [e-mail]; [e-mail]

^IIEmpresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária, Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Parque Estação Biológica, Av W5 Norte (Final), 70770-900, Brasília, DF; [e-mail]; [e-mail]; [e-mail]; [e-mail]

RESUMO

Aedes aegypti (L.) é vetor de importantes doenças como a febre amarela e a dengue, presentes em regiões tropicais e subtropicais. Para o sucesso no seu controle biológico é importante conhecer a estrutura genética e os mecanismos que resultaram na diversidade das populações. O objetivo deste estudo foi analisar a variabilidade genética de diferentes populações de A. aegypti utilizando marcadores de RAPD (Polimorfismo de DNA amplificado ao acaso). DNA de dez larvas coletadas a partir de três populações de diferentes localidades foi analisado usando dez iniciadores de RAPD. Os resultados indicaram a existência de variabilidade genética inter e intrapopulacional. Isso foi confirmado por um dendrograma que agrupou as populações em dois blocos principais com similaridade genética de 24%. Em um desses agrupamentos foi possível distinguir duas populações que apresentaram grau de similaridade de 50%. A diversidade genética entre as populações (55,01%) foi mais elevada que a diversidade genética dentro das populações (44,99%) aplicando-se análise por AMOVA. Altos níveis de polimorfismo genético (H_t = 0.2656) e de diferenciação genética entre as populações (G_st = 0.3689) foram observados. Além disso, o protocolo de extração de DNA adotado mostrou-se eficiente para a análise do inseto independente do seu estágio de desenvolvimento, evitando-se o acréscimo de reagentes ou etapas adicionais de processamento. Futuros experimentos poderão ser realizados para confirmar se a variabilidade observada pode estar ligada às características de resistência de cada população a um determinado pesticida.

Palavras-chave: Vetor da dengue, genética de populações, resistência

ABSTRACT

Aedes aegypti (L.) is an important vector of diseases such as the yellow fever and dengue, present in tropical and subtropical regions. The objective of this study was to analyze the genetic variability of different A. aegypti populations using RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) markers as a basic study to support the use of biocontrol strategies. DNA of ten collected larvae from three different populations were analyzed using ten RAPD primers. The results indicated the existence of genetic variability inter and intrapopulation. This was confirmed by a dendrogram that grouped the populations in two main clusters with a genetic similarity of 24%. In one of these clusters, it was possible to distinguish two populations that showed 50% similarity. The molecular variance analysis indicated that the interpopulation genetic diversity (55,01%) was higher than the intrapopulation genetic diversity (44,99%). A high genetic polymorphism (H_t = 0.2656) and high levels of genetic differentiation between populations (G_st = 0.3689) were found. The adopted DNA extraction protocol proved to be efficient regardless the insect development stage used, avoiding the addition of reagents or additional stages of processing. Future experiments can be performed to confirm if the detected variability is related to the resistance characteristics of each population to a determined pesticide.

Key words: Dengue vector, population genetic, resistance

Aedes aegypti (L.) é um mosquito doméstico com atividade hematofágica diurna que utiliza, preferencialmente, depósitos artificiais de água limpa para colocar seus ovos (Tauil 2002). Originário provavelmente da Etiópia, adquiriu grande capacidade de adaptação ao domicílio humano, acompanhando os povos em suas migrações pela terra (Gadelha & Toda 1985). Desse modo, a espécie desenvolveu um comportamento estritamente sinantrópico e antropofílico em sua trajetória evolutiva, sendo reconhecido entre os culicídeos como a espécie mais associada ao homem. A fêmea alimenta-se mais de uma vez entre duas oviposições sucessivas, especialmente quando perturbada antes de estar totalmente ingurgitada, aumentando a possibilidade da ingestão e transmissão de vírus (Barata et al 2001), destacando-se a dengue.

A dengue é uma importante arbovirose que acomete o homem e constitui grave problema de saúde pública no Brasil e na maioria dos países tropicais, cujas condições climáticas favorecem sua proliferação. Aedes aegypti é uma das espécies de maior distribuição no país, estando presente em 3.970 municípios (SVS/MS 2008). Tem grande importância epidemiológica por estar envolvida na transmissão do vírus da febre amarela e de quatro sorotipos da dengue, incluindo a versão hemorrágica que acomete indivíduos nas áreas tropicais e subtropicais (Ayres et al 2002).

Em 2008, foram registrados 230.829 casos notificados de dengue, sendo 1.069 casos confirmados de Febre Hemorrágica da Dengue (FHD) e 77 óbitos por FHD. Na Região Centro-Oeste, foram notificados 20.936 casos de dengue, com redução de 71,72% quando comparado ao mesmo período de 2007. Foram confirmados 38 casos de FHD, com três óbitos e oito casos de dengue com complicação, com cinco óbitos. Goiás e o Distrito Federal apresentaram aumento no número de notificações de 40,79% e 15,36% respectivamente, e reduções foram observadas no Mato Grosso do Sul (96,10%) e Mato Grosso (57,70%) (SVS/MS 2008).

A habilidade de adaptação de um organismo depende da sua variabilidade genética. A informação da variação genética dentro e entre as populações é importante para compreender a história evolutiva de populações de mosquitos e da epidemiologia da doença (Yan et al 1998). O estudo da estrutura genética da população é essencial para o entendimento da dinâmica das populações do A. aegypti e para a análise de fatores responsáveis pela resistência e adaptação ecológica. Vários estudos têm investigado a variabilidade genética de populações de culicídeos, utilizando marcadores moleculares tais como isoenzimas (Laranja et al 2003, Souza-Polezzi & Bicudo 2004), DNA mitocondrial (Bosio et al 2005), RAPD (Polimorfismo de DNA Amplificado ao Acaso) (Paduan et al 2006) e microssatélites (Chambers et al 2007).

A técnica de RAPD tem como base a PCR (Polymerase Chain Reaction) que permite a detecção de polimorfismos entre indivíduos de uma mesma população. É uma técnica interessante para estudos de genética de populações, e aumenta as chances de análises mais global de genomas (Williams et al 1990, Apostol et al 1996). A desvantagem vem de essa técnica estar restrita à análise de marcadores que apresentem comportamento genético dominante. Entretanto, a amplificação do DNA é gerada de forma simples e a baixo custo, sem necessidade de conhecimento prévio de sequências do genoma, sendo a mesma utilizada com sucesso na identificação e diferenciação de populações de A. aegypti baseada na variação genética (Ayres et al 2003, Ocampo & Wesson 2004).

Utilizando marcadores RAPD, foi observado que a estrutura genética de populações do culicídeo, de onze localidades pertencentes a seis estados brasileiros, apresenta alta variabilidade e altos níveis de diferenciação entre as populações (Paduan et al 2006). Ainda é possível detectar modelos locais de fluxo gênico e isolamento por distância de populações de A. aegypti (Gorrochotegui-Escalante et al 2002) e estimar níveis de polimorfismo intraespecífico e relações genéticas entre populações do inseto (De Sousa et al 2001).

O presente trabalho teve por objetivos obter perfis eletroforéticos de RAPD específicos para populações resistentes a inseticidas e determinar a variabilidade genética inter e intrapopulacional de três populações de A. aegypti submetidas a três diferentes condições ambientais.

Material e Métodos

Foram analisadas três populações de A aegypti: Bthek, Resistente e Roc. A população denominada Bthek foi originária da criação da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia (Brasília, DF, Brasil, 1º43'48.74''S e 47º54'76''W), mantida há cinco anos e revigorada anualmente com introdução de indivíduos de campo coletados nas cidades satélites do Distrito Federal. Essa população nunca foi submetida a tratamentos químicos ou biológicos em campo. A população Resistente foi originária de Planaltina (DF) e mantida no Instituto de Saúde (Brasília, DF, Brasil, 15º46'50.38''S e 47º52'21.55''W) há quatro anos. Foi detectada nessa população resistência ao temefós em campo, confirmada por bioensaios em 2001 (Carvalho et al 2004). A população Rock, originária da Flórida, também mantida no Instituto de Saúde (Brasília, DF, Brasil 15º46'50.38''S e 47º52'21.55''W) há mais de dez anos, é considerada internacionalmente como suscetível a inseticidas, inclusive ao temefós.

Para a obtenção do DNA, utilizou-se o procedimento descrito por Ayres et al (2002). Foram utilizadas 10 larvas de parentais diferentes de cada uma das três populações de A. aegypti, para obtenção de perfis eletroforéticos de 10 loci RAPD (OPA-01, OPA-02, OPA-03, OPA-04, OPA-10, OPA-11, OPA-12, OPA-13, OPA-15 ou OPA-20 da Operon Technologies Inc., CA. USA).

Para testar a viabilidade da técnica utilizada para extração de DNA descrita por Ayres et al (2002) aos diferentes estágios do ciclo de vida desse culicídeo, foram coletados, aleatoriamente, dez indivíduos de cada fase de desenvolvimento (larva, pupa e adulto) de uma colônia mantida no laboratório de criação de insetos da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia.

Para estudos de caracterização molecular e viabilidade do DNA nos diferentes estágios de vida do inseto, o DNA foi diluído 5x (100 ng/µl) em TE (Tris-EDTA) 0,1x. Cada reação de amplificação foi realizada no volume total de 30 µl, contendo DNA (100 ng/µl), tampão 1x (10 mM Tris-HCl pH 9.0, 50 mM KCl, 2 mM MgCl2), dNTPs (10 mM), iniciadores (10 µM) e enzima Taq DNA polimerase (GE Healthcare) (2,5 U).

As amplificações foram efetuadas em termociclador PTC 100 (MJ Research) programado para 45 ciclos, contendo uma etapa inicial de desnaturação de 3 min a 94ºC. Cada ciclo foi constituído de uma etapa de desnaturação de 1 min a 93ºC, anelamento por 1 min a 35ºC e extensão por 2 min a 72ºC. Após os ciclos, foi realizada uma etapa de extensão final de 5 min a 72ºC.

Os produtos de amplificação originários das reações de RAPD foram separados em gel de agarose 1,5% em tampão TBE 1X (Tris-borato 90 mM e EDTA 1 mM) durante 3h a 160 V. Ao término da corrida, os géis foram corados por 30 min em solução contendo brometo de etídio (5 µg/ml), descorados por 30 min em água destilada e fotografado sob luz ultravioleta no comprimento de onda de 300 nm. A documentação fotográfica foi feita utilizando-se do sistema EagleEye II still video system^TM (Stratagene). Em todos os géis, marcadores de massa molecular (100 bp Ladder - INVITROGEN) foram usados para a determinação da massa molecular dos fragmentos amplificados pela técnica de RAPD.

A matriz de similaridade foi obtida por meio do coeficiente de Jaccard (Sneath & Sokal 1973), que foi submetida a análise por UPGMA (Unweighted Pair-Group Method Analysis), para produção de dendrograma, utilizando-se do programa NTSYS (Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System) versão 2.02 pc (Rholf 1993). Os dados obtidos foram utilizados na análise de variância molecular (AMOVA) para a determinação estatística das possíveis origens das variabilidades encontradas nas populações pela aplicação de algoritmos específicos do programa Arlequin ver. 2000 (Schneider et al 2000). O programa PopGene (Yeh & Boyle 1997) foi usado para determinar a heterozigosidade, o número de loci polimórficos e os índices de Gst e Nm.

Resultados

Os dez iniciadores utilizados geraram 127 produtos de amplificação, sendo 60 (48%) polimórficos. Cada um desses iniciadores produziu a média de 14 fragmentos de DNA. A faixa de tamanho dos fragmentos de DNA variou de 200 pb a 1800 pb na população Bthek, de 300 pb a 2000 pb na população Resistente e de 250 pb a 2000 pb na população Roc.

Para o iniciador OPA11, os indivíduos da população Bthek apresentaram fragmentos característicos de 500 pb, 1400 pb e 2500 pb. Na população resistente ao inseticida temefós, observaram-se bandas em comum com a população anterior e a presença de um fragmento exclusivo de 2000 pb, sendo na população Rock observado um fragmento exclusivo de 1800 pb (Fig 1).

Foram detectados dois fragmentos monomórficos, ou seja, presentes em todos os indivíduos das três populações analisadas. Um fragmento de 450 pb (resultado de amplificação pelo iniciador OPA 12) e outro de 500 pb (resultado de amplificação pelo iniciador OPA 13).

Usando-se o programa NTSYS foi possível o agrupamento das populações em dois blocos principais, com base nos perfis eletroforéticos de RAPD (Fig 2). O agrupamento A foi constituído apenas pela população Bthek, mantida na criação em Brasília, DF. Essa população apresentou 24% de similaridade genética com as populações que formaram o agrupamento B (Resistente e a Rock). As duas populações apresentaram entre si 50% de similaridade genética. Além disso, houve separação das populações, sem que ocorresse agrupamento de indivíduos de populações diferentes.

As análises de variância molecular (AMOVA) indicaram que 44,99% da variação observada resultou de variações dentro das populações e que 55,01% da variação observada originou-se de variações entre as populações (Tabela 1). A heterozigosidade média (H_t ) foi de 0.2656. A diferenciação genética total entre as populações de A. aegypti estudadas foi alta (G_st = 0.3689; N_m = 0.8554).

Discussão

A técnica de RAPD tem sido aplicada em estudos de caracterização molecular e variabilidade genética. Estudos populacionais de insetos também têm utilizado essa técnica para examinar a estrutura de cruzamento (Su et al 2003), construção eficiente de mapas de ligação em populações de A. aegypti ou estudos taxonômicos de insetos, principalmente em nível intra-específico (Antolin et al 1996) e fluxo gênico (Garcia-Franco et al 2002).

Pelas análises dos marcadores, as populações Roc e Resistente apresentam maior similaridade genética (50%) do que em relação aos indivíduos originários da criação da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, denominada de Bthek, usada como perfil de comparação (24%) (Fig 2). Vale ressaltar que tanto a população Roc como a Resistente são mantidas no mesmo local (Instituto de Saúde DF) e é comum fuga de alguns insetos durante a manutenção das gaiolas, permitindo troca de indivíduos de populações diferentes.

Os resultados assemelham-se aos dados de um estudo feito com populações desse culicídeo coletadas em diferentes regiões geográficas do estado de São Paulo e populações de laboratório. De acordo com os padrões de RAPD, as populações foram separadas em dois grupos principais, um grupo com mosquitos da Região Oeste do estado de São Paulo e outro grupo com mosquitos de uma cepa de laboratório, juntamente com mosquitos de cidade litorânea onde se localiza o maior porto da América Latina (Santos et al 2003).

A variabilidade genética entre as populações analisadas (55,01%) foi maior do que a observada dentro das populações (Tabela 1). Isso também foi observado em duas amostras de A. aegypti coletadas durante a epidemia de 1997 em Santiago de Cuba, e que foram analisadas pela técnica de RAPD-PCR (Bisset et al 2005). A partir da análise de 18 loci isoenzimáticos também foi constatado, em populações desse culicídeo de quatro vizinhanças da cidade de Manaus, AM, que apesar de elas de serem semelhantes geneticamente (D = 0.003 a 0.016), a diferenciação de 4,88% entre as populações foi significante (Fraga et al 2003).

A heterozigosidade média entre os 10 loci de RAPD (H_t = 0,2636) foi menor do que em análises de populações brasileiras com 21 (H_t = 0,388) (Paduan et al 2006) e 27 loci de RAPD (H_t = 0,390) (Ayres et al 2003) e de populações de Porto Rico, com 57 loci de RAPD (H_t = 0,354) (Apostol et al 1996). A diferenciação genética entre as populações de A. aegypti deste estudo foi significativa, indicando que essas populações são altamente diferenciadas (G_st = 0,3689; N_m = 0.8554). Os valores foram semelhantes aos descritos para outras populações dessa espécie no Brasil (G_st = 0,317; N_m = 0.54 - Ayres et al 2003, (G_st = 0,430; N_m = 0,65 - Paduan et al 2006) e Argentina (G_st = 0,249; N_m = 0.75 - De Souza et al 2001).

Populações estruturadas geralmente mostram equilíbrio dinâmico entre fatores que favorecem a diferenciação (mutação, deriva e seleção natural direcional ou disruptiva, diferente em cada área) e fatores homogeneizadores (migração e seleção natural balanceada ou diferencial, uniforme em cada área) (Solé-Cava 2001). No presente estudo, as análises mostram a presença de dois agrupamentos, sugerindo que essas populações podem estar sob processo de diferenciação genética direcionada por fatores ecológicos, evolucionários e históricos.

Os marcadores de RAPD utilizados foram eficientes na diferenciação genética preliminar entre populações do Distrito Federal parcialmente isoladas, e também na detecção de fragmentos interessantes para estudos de resistência e suscetibilidade.

A exclusividade do fragmento de 2000 pb para o locus OPA-11 na população de Planaltina (Resistente) indica uma possível exploração do mesmo como marcador molecular na identificação de populações resistentes no campo ao inseticida temefós. No entanto, estudos adicionais com marcadores moleculares mais específicos são necessários para confirmar esse potencial.

Caso confirmado, isso é particularmente interessante em termos de manejo integrado, uma vez que poderá ser empregado na identificação de populações resistentes a produtos químicos. Havendo resultado molecular positivo para a resistência a um dado produto químico, poderão ser adotadas outras estratégias, tais como, o emprego de outros inseticidas ou o emprego do controle biológico pela utilização de estirpes de Bacillus thuringiensis. Possivelmente, o uso de produtos químicos está selecionando populações com perfis de marcadores moleculares específicos. O entendimento dessa dinâmica molecular poderá auxiliar no planejamento de estratégias de controle biológico para populações específicas de A. aegypti.

Received 13/II/08.

Accepted 11/III/09.

Edited by Neusa Hamada - INPA

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  14 Set 2009
• Data do Fascículo
  Ago 2009

Histórico

• Aceito
  11 Mar 2009
• Recebido
  13 Fev 2008