Híbridos envolvendo as espécies Pseudoplatystoma corruscans vs. Pseudoplatystoma reticulatum são amplamente comercializados por apresentarem maior docilidade e precocidade quando comparados aos parentais. Neste trabalho objetivou-se identificar, por meio de técnicas moleculares, a existência de surubins híbridos em rios do estado do Mato Grosso do Sul. Pseudoplatystoma corruscans, Pseudoplatystoma reticulatum e 'Surubim' híbrido foram identificados utilizando as técnicas de PCR multiplex e PCR-RFLP dos genes nucleares RAG2, GLOBINA, EF1α, 18S rRNA e mitocondrial 16S rRNA. Os resultados demonstraram a presença de híbridos F1 em rios e a ocorrência da introgressão genética, evidenciada pelos híbridos Pós-F1. Além disso, foram observadas discrepâncias entre a identificação morfológica e genética, demonstrando a eficácia da utilização de diversos marcadores moleculares para identificação correta destes híbridos. Torna-se evidente a necessidade da implantação de projetos de manejo e conservação, a fim de manter a integridade genética de populações de espécies nativas em rios do estado do Mato Grosso do Sul, que encontram-se ameaçadas pela hibridação.