Poucos estudos ictiofaunísticos estão disponíveis em rios típicos do semi-árido, apesar da constante ameaça à diversidade local devido a influências antrópicas, com destaque para o represamento e construção de barragens. O presente trabalho teve como objetivo avaliar, por meio de diferentes metodologias, a estrutura genética de populações de uma espécie de caracídeo, Astyanax aff. bimaculatus, amplamente distribuída em bacias hidrográficas da Bahia, Nordeste do Brasil. Análises morfológicas (dados merísticos e morfométricos), citogenéticas (cariótipo e Ag-RONs) e moleculares (RAPD e SPAR) foram realizadas em espécimes coletados à montante e à jusante da Barragem da Pedra, na calha principal do médio rio de Contas (bacia do Rio de Contas) e no ribeirão Mineiro, pertencente à bacia adjacente do Recôncavo Sul. Poucas diferenças externas foram detectadas entre as populações, sendo os indivíduos originários do reservatório, à montante da barragem, ligeiramente maiores. Os dados citogenéticos também mostraram padrões cariotípicos semelhantes (2n=50; 6m+28sm+12st+4a; FN= 96) e RONs situadas nos braços curtos de até dois pares cromossômicos, com variação numérica inter- e intra-populacional. Contudo, as análises por RAPD e SPAR diferenciaram as três populações de forma eficiente, revelando freqüências alélicas significativamente diferentes entre as localidades amostradas e índices significativos de estruturação populacional (Fst=0.1868, P<0.0001). As diferenças entre populações do mesmo rio foram tão significativas quanto entre bacias hidrográficas distintas, indicando que a represa constitui uma barreira eficiente ao fluxo gênico. Além disso, acredita-se que peculiaridades ambientais de cada localidade possam também influenciar os padrões genéticos encontrados. Por outro lado, a similaridade entre amostras das bacias do Rio de Contas e Recôncavo Sul pode estar relacionada a uma história evolutiva comum, já que ambas estão geograficamente próximas. Por fim, o presente estudo demonstra que a realização de estudos envolvendo diferentes marcadores é extremamente útil para a identificação de estruturas de populações em espécies amplamente distribuídas e para avaliação dos impactos das atividades humanas sobre as populações naturais de peixes.