Relationship between toxicity of Vip3Aa proteins and their binding capacity to intestine receptors of lepidopteran pests

The objective of this work was to evaluate the toxicity of new Vip3Aa proteins and their binding capacity to brush-border membrane vesicles (BBMV) in the intestine of Spodoptera frugiperda, Anticarsia gemmatalis, and Heliothis virescens neonate larvae. The proteins expressed by the genes vip3Aa42 and vip3Aa43 showed toxicity to S. frugiperda (LC₅₀ of 78.2 and 113 ng cm^-2, respectively) and A. gemmatalis(LC₅₀ of 239.2 and 57.5 ng cm^-2, respectively), but they showed low toxicity to H. virescens (LC₅₀>5,000 ng cm^-2). BBMV binding assays showed that the proteins bind effectively to the receptors on vesicles of the evaluated species, but this binding capacity is only effective on the activation of toxicity to the evaluated populations of S. frugiperda and A. gemmatalis.

Index terms:
Anticarsia gemmatalis; Heliothis virescens; Spodoptera frugiperda; management of resistance; Cry proteins; membrane vesicles

Authorship

Suzana Cristina Marucci

Universidade Estadual Paulista (Unesp), Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Departamento de Biologia Aplicada à Agropecuária, Rodovia Prof. Paulo Donato Castellane, s/no, Zona Rural, CEP 14884-900 Jaboticabal, SP, Brasil. E-mail: suzy_marucci@yahoo.com.br, camila_sfigueiredo@hotmail.com, elianea@fcav.unesp.br, mvictor@fcav.unesp.br, janete@fcav.unesp.brUniversidade Estadual PaulistaBrazilJaboticabal, SP, BrazilUniversidade Estadual Paulista (Unesp), Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Departamento de Biologia Aplicada à Agropecuária, Rodovia Prof. Paulo Donato Castellane, s/no, Zona Rural, CEP 14884-900 Jaboticabal, SP, Brasil. E-mail: suzy_marucci@yahoo.com.br, camila_sfigueiredo@hotmail.com, elianea@fcav.unesp.br, mvictor@fcav.unesp.br, janete@fcav.unesp.br

Camila Soares Figueiredo

Renata Izabel Dozzi Tezza

Universidade Estadual Paulista (Unesp), Centro de Recursos Biológicos e Biologia Genômica, CEP 14884-900 Jaboticabal, SP, Brasil. E-mail: renata25@fcav.unesp.brUniversidade Estadual PaulistaBrazilJaboticabal, SP, BrazilUniversidade Estadual Paulista (Unesp), Centro de Recursos Biológicos e Biologia Genômica, CEP 14884-900 Jaboticabal, SP, Brasil. E-mail: renata25@fcav.unesp.br

Eliane Cristina da Cunha Alves

Manoel Victor Franco Lemos

Janete Apparecida Desidério

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Figura 1:
Análise de SDS-PAGE 12% das proteínas totais dos lisados proteicos de clones de Escherichia coliBL21(DE3), transformados com os genes vip3Aa42 e vip3Aa43. Os genes foram clonados em vetor de expressão pET Sumo, e a expressão foi induzida. M, marcador de massa molecular Spectra Multicolor Broad Range Protein Ladder (Thermo Scientific, Rockford, IL, EUA), em kDa; 1, gene vip3Aa42 não induzido; 2, gene vip3Aa42 induzido; 3, gene vip3Aa43 não induzido; e 4, gene vip3Aa43 induzido. As proteínas recombinantes possuem massa de 101,5 kDa (setas), da qual 88,5 kDa das proteínas Vip3Aa e 13 kDa referentes à fusão, na região N-terminal, de uma cauda com 6 histidinas e uma proteína Sumo, presentes no vetor pET Sumo.

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Figura 2:
Análise de SDS-PAGE 12% das proteínas Vip3Aa42 (A) e Vip3Aa43 (B) ativadas. M, marcador de massa molecular Spectra Multicolor Broad Range Protein Ladder (Thermo Scientific), em kDa; 1, proteína purificada; 2, proteína ativada com tripsina pancreática bovina (Sigma- Aldrich); 3, proteína ativada com suco intestinal de Spodoptera frugiperda; 4, proteína ativada com suco intestinal de Anticarsia gemmatalis; e 5, proteína ativada com suco intestinal de Heliothis virescens.

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Figura 3:
Ensaio de ligação e competição homóloga das proteínas Vip3Aa42 e Vip3Aa43 às vesículas de membrana da microvilosidade apical (VMMAs) de Spodoptera frugiperda, Anticarsia gemmatalis e Heliothis virescens.Aa42, ligação da proteína Vip3Aa42, marcada com biotina, à VMMA; Aa43, ligação da proteína Vip3Aa43, marcada com biotina, à VMMA. Competição homóloga: 500X, 1.000X e 2.000X de proteína não marcada em excesso.

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Tabela 1:
Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para amplificação e sequenciamento dos genes vip3Aa das linhagens de Bacillus thuringiensis var.tolworthi HD125 e Bacillus thuringiensis var. kurstaki HD1.

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Tabela 2:
Concentração letal (CL₅₀ e CL₉₀)⁽¹⁾ das proteínas Vip3Aa42 e Vip3Aa43, em neonatas de Spodoptera frugiperda, Anticarsia gemmatalis e Heliothis virescens.

Figura 1: Análise de SDS-PAGE 12% das proteínas totais dos lisados proteicos de clones de Escherichia coliBL21(DE3), transformados com os genes vip3Aa42 e vip3Aa43. Os genes foram clonados em vetor de expressão pET Sumo, e a expressão foi induzida. M, marcador de massa molecular Spectra Multicolor Broad Range Protein Ladder (Thermo Scientific, Rockford, IL, EUA), em kDa; 1, gene vip3Aa42 não induzido; 2, gene vip3Aa42 induzido; 3, gene vip3Aa43 não induzido; e 4, gene vip3Aa43 induzido. As proteínas recombinantes possuem massa de 101,5 kDa (setas), da qual 88,5 kDa das proteínas Vip3Aa e 13 kDa referentes à fusão, na região N-terminal, de uma cauda com 6 histidinas e uma proteína Sumo, presentes no vetor pET Sumo.

Figura 2: Análise de SDS-PAGE 12% das proteínas Vip3Aa42 (A) e Vip3Aa43 (B) ativadas. M, marcador de massa molecular Spectra Multicolor Broad Range Protein Ladder (Thermo Scientific), em kDa; 1, proteína purificada; 2, proteína ativada com tripsina pancreática bovina (Sigma- Aldrich); 3, proteína ativada com suco intestinal de Spodoptera frugiperda; 4, proteína ativada com suco intestinal de Anticarsia gemmatalis; e 5, proteína ativada com suco intestinal de Heliothis virescens.

Figura 3: Ensaio de ligação e competição homóloga das proteínas Vip3Aa42 e Vip3Aa43 às vesículas de membrana da microvilosidade apical (VMMAs) de Spodoptera frugiperda, Anticarsia gemmatalis e Heliothis virescens.Aa42, ligação da proteína Vip3Aa42, marcada com biotina, à VMMA; Aa43, ligação da proteína Vip3Aa43, marcada com biotina, à VMMA. Competição homóloga: 500X, 1.000X e 2.000X de proteína não marcada em excesso.

Tabela 1: Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para amplificação e sequenciamento dos genes vip3Aa das linhagens de Bacillus thuringiensis var.tolworthi HD125 e Bacillus thuringiensis var. kurstaki HD1.

⁽¹⁾
Iniciadores Vip5 e Vip6, obtidos de Loguercio et al. (2002)LOGUERCIO, L.L.; BARRETO, M.L.; ROCHA, T.L.; SANTOS, C.G.; TEIXEIRA, F.F.; PAIVA, E. Combined analysis of supernatant-based feeding bioassays and PCR as a first-tier screening strategy for Vip-derived activities in Bacillus thuringiensis strains effective against tropical fall armyworm. Journal of Applied Microbiology, v.93, p.269-277, 2002. DOI: 10.1046/j.1365-2672.2002.01694.x.
https://doi.org/10.1046/j.1365-2672.2002... ; e iniciadores A1-A6, obtidos no presente trabalho.
⁽²⁾
Códons ATG e TTA sublinhados representam o códon de início e o códon de terminação, respectivamente; d, direto; r, reverso.

Tabela 2: Concentração letal (CL₅₀ e CL₉₀)⁽¹⁾ das proteínas Vip3Aa42 e Vip3Aa43, em neonatas de Spodoptera frugiperda, Anticarsia gemmatalis e Heliothis virescens.

⁽¹⁾
Valores entre parênteses representam o intervalo de confiança, com 95% de probabilidade. EP, erro-padrão da média.

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Relationship between toxicity of Vip3Aa proteins and their binding capacity to intestine receptors of lepidopteran pests

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[TFN1] ⁽¹⁾
Iniciadores Vip5 e Vip6, obtidos de Loguercio et al. (2002)LOGUERCIO, L.L.; BARRETO, M.L.; ROCHA, T.L.; SANTOS, C.G.; TEIXEIRA, F.F.; PAIVA, E. Combined analysis of supernatant-based feeding bioassays and PCR as a first-tier screening strategy for Vip-derived activities in Bacillus thuringiensis strains effective against tropical fall armyworm. Journal of Applied Microbiology, v.93, p.269-277, 2002. DOI: 10.1046/j.1365-2672.2002.01694.x.
https://doi.org/10.1046/j.1365-2672.2002... ; e iniciadores A1-A6, obtidos no presente trabalho.

[TFN2] ⁽²⁾
Códons ATG e TTA sublinhados representam o códon de início e o códon de terminação, respectivamente; d, direto; r, reverso.