Estrutura genética e sistema de acasalamento de Piper hispidinervum

Genetic structure and mating system of Piper hispidinervum

GENÉTICA

Estrutura genética e sistema de acasalamento de Piper hispidinervum

Genetic structure and mating system of Piper hispidinervum

Lúcia Helena de Oliveira Wadt^I; Paulo Yoshio Kageyama^II

^IEmbrapa Acre, Caixa Postal 321, CEP 69908-970 Rio Branco, AC. E-mail: [e-mail]

^IIEscola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Dep. de Ciências Florestais, Av. Pádua Dias, 11, CEP 13418-970 Piracicaba, SP. E-mail: [e-mail]

RESUMO

A pimenta-longa (Piper hispidinervum C. DC.) arbusto encontrado em áreas antropizadas no Estado do Acre, possui expressiva importância econômica decorrente da presença de safrol em seu óleo essencial. O objetivo deste trabalho foi avaliar a estrutura genética e o sistema de acasalamento dessa espécie, utilizando marcadores RAPD (polimorfismo de DNA amplificado ao acaso). A diversidade genética entre e dentro de populações naturais foi avaliada em 13 populações do Vale do Rio Acre, distribuídas nas Regiões do Baixo e Alto Acre. A taxa preferencial de cruzamento foi estimada em 25 famílias de polinização livre de uma população do Município de Assis Brasil, Acre. A espécie apresentou diversidade genética estruturada no espaço segundo um padrão de isolamento por distância. A maior parte da variabilidade genética foi encontrada dentro das populações, porém a diferenciação entre populações, como um todo, foi alta (q_P = 0,28). O agrupamento das populações, pela distância genética (f_ST) entre elas, mostrou dois grupos distintos, os quais representam as regiões do Alto Acre e Baixo Acre. A AMOVA mostrou que 20,61% da variabilidade total está entre essas duas regiões. A taxa de cruzamento multilocos foi estimada em 1,033, evidenciando que a espécie é alógama. A estimativa do coeficiente de endogamia F não diferiu de zero e os cruzamentos ocorreram preferencialmente entre indivíduos não-aparentados.

Termos para indexação: pimenta, RAPD, variação genética, cruzamento.

ABSTRACT

Long pepper (Piper hispidinervum C. DC.) is a small tree with high commercial value found in areas under anthropic influence in the State of Acre, Brazil. The genetic structure and mating system of P. hispidinervum were evaluated using RAPD markers. The genetic diversity within and between natural populations were evaluated in 13 populations in the Basin Acre River - Western Brazilian Amazon. Twenty five open-pollinating families in a population located in Assis Brasil were evaluated to estimate the preferential crossing rate. Genetic diversity was observed, revealing that this species is spatially structured according to a pattern of isolation by distance. Most of the genetic variability was found within populations, and the variation between populations was also high (q_P = 0.28). Two distinct groups were formed, based on genetic distances (f_ST), representing the Upper Acre and Lower Acre watersheds. By AMOVA, 20.61% of the total variability occurs between those two watershed regions. The multilocus crossing rate was estimated at 1.033, the estimate of the inbreeding coefficient (F) did not vary from zero, and the crosses preferentially occurred between unrelated individuals.

Index terms: pepper, RAPD, genetic variation, crossbreeding.

Introdução

O processo de sucessão corresponde à recuperação de clareiras abertas ou áreas desmatadas, decorrentes de diversos tipos de perturbação. A área desmatada afeta o microclima local que, por sua vez, determina o estabelecimento de diferentes espécies em função do grupo ecológico a que pertencem (Kageyama et al., 1992).

Resultados obtidos em laboratório indicam que P. hispidinervum é uma espécie típica de ambientes abertos, apresentando sementes com baixa longevidade em condições naturais. Em áreas de pastagem, apresenta banco de sementes restrito, com dispersão durante o ano todo, sendo considerada uma espécie pioneira antrópica, por colonizar áreas perturbadas (Almeida, 1999).

As populações naturais de P. hispidinervum são densas, com domínio dessa espécie sobre as demais. Estudos sobre a produção e dispersão de sementes de P. hispidinervum revelaram uma baixa produção em indivíduos isolados ou espiguetas ensacadas, sugerindo a existência de certo grau de auto-incompatibilidade (Silva & Oliveira, 2000). Também foi evidenciado que quanto maior a distância da planta-mãe, maior o número de sementes dispersas, confirmando a hipótese de dispersão por aves ou morcegos, sugerida por Almeida (1999).

Em populações naturais, a distribuição da variabilidade genética é influenciada pelo modo de reprodução, sistema de acasalamento, tamanho da população, distribuição geográfica e fluxo gênico da espécie (Hamrick, 1983).

A maneira mais usual de se conhecer o sistema de acasalamento de uma espécie é pela estimativa da taxa de cruzamento (t). Marcadores RAPD (polimorfismo de DNA amplificado ao acaso), embora de caráter dominante, têm sido utilizados para estimar parâmetros genéticos que definem a estrutura de populações (Ayres & Ryan, 1999; Keller, 2000) e a taxa de cruzamento (Gjuric & Smith Junior, 1996; Gaiotto et al., 1997). No entanto, Bekessy et al. (2003) alertam para o uso desse tipo de marcador quando o objetivo é obter informações sobre o potencial adaptativo das populações, pois verificaram que marcadores neutros não são apropriados para tal finalidade.

O balanço entre o sistema de acasalamento de uma espécie e a deriva genética é um fator muito importante a ser considerado na conservação ou manejo de recursos genéticos, pois em espécies alógamas, populações pequenas podem favorecer a depressão por endogamia (Barrett & Kohn, 1991). Assim, o conhecimento da estrutura genética e a determinação da forma preferencial de acasalamento de uma espécie são fundamentais para definir o manejo adequado ou a sua domesticação.

O objetivo deste trabalho foi avaliar a estrutura genética e o sistema de acasalamento em populações naturais de P. hispidinervum, usando marcadores RAPD.

Material e Métodos

Treze populações naturais de P. hispidinervum, distribuídas em oito municípios do Vale do Rio Acre, foram avaliadas para estimativa da sua estrutura genética (Tabela 1). De cada população, foram amostrados, aleatoriamente, 23 indivíduos, coletando-se de cada um quatro folhas jovens e expandidas, as quais foram secadas em sílica gel. O protocolo de extração e amplificação utilizado foi segundo Ferreira & Grattapaglia (1996). Foram utilizados oito primers da Operon Technologies (OP-A12, OP-B08, OP-B11, OP-C06, OP-D02, OP-D11, OP-D12 e OP-D20).

Os locos RAPD foram avaliados pela presença (1) e ausência (0) de bandas, obtendo-se uma matriz de fenótipos moleculares. Foram calculados os porcentuais de polimorfismo total e de cada população; as distâncias genéticas entre os pares de populações; e a distribuição da variabilidade genética entre e dentro de populações e regiões geográficas. As estimativas das distâncias genéticas e da variabilidade genética entre populações foram calculadas usando o software AMOVA (Análise da Variância Molecular) e o agrupamento das populações foi feito pelo método UPGMA (Método da Média Aritmética não Ponderada)) (NTSYS-pc versão 1.70), sendo construído um dendrograma para a visualização dos grupos.

Os mesmos dados foram analisados simulando-se equilíbrio de Hardy-Weimberg em todas as populações. Foram feitas estimativas das freqüências alélicas de cada população; da porcentagem de locos polimórficos em cada população; e das estimativas de teta (q), pelo método de Weir & Cockerham (1984), usando-se o software TFPGA (Ferramentas para Análise de Genética de População). As estimativas de q correspondem à estatística-F_ST de Wright, onde q_P refere-se à diferenciação genética entre grupos e q_S à diferenciação entre populações. A fim de se diminuir o viés nas estimativas das freqüências alélicas, estas foram estimadas segundo o método descrito por Lynch & Milligan (1994), baseado na Expansão de Taylor.

Para o cálculo da taxa de cruzamento, foram avaliadas 25 famílias amostradas na população de Assis Brasil, AC. De cada planta-mãe foram coletadas sementes para produção de mudas e constituição das progênies. Após três meses do plantio no campo experimental, foram coletadas folhas de 15 indivíduos de cada família para análise de marcadores RAPD. Folhas das plantas-mãe também foram coletadas para análise.

Foram utilizados nove primers da Operon Technologies (OP-B11, OP-D02, OP-D11, OP-D12, OP-AA11, OP-AA19, OP-AB01, OP-AB05 e OP-AB18). Os fenótipos moleculares das progênies e os genótipos maternos, estimados com base na progênie, foram analisados pelo programa MLDT (Estimativa de Cruzamento Multilocus com Marcadores Dominantes), desenvolvido por Ritland (1990), o qual estima a taxa de fecundação cruzada multilocus da população (tm), a taxa de fecundação cruzada "singlelocus" (ts), as freqüências alélicas da população (pi), o coeficiente de endogamia da geração dos genitores (F), a taxa de cruzamento preferencial entre indivíduos aparentados (tm – ts), e a taxa de cruzamento para cada família.

Cada loco RAPD foi avaliado pelo teste qui-quadrado, quanto à aderência ao modelo misto de reprodução. A variância dos parâmetros avaliados foi estimada por 1.000 reamostragens (bootstraps) feitas dentro de famílias.

O coeficiente de endogamia da geração dos genitores (F) foi comparado com o coeficiente de endogamia aparente das progênies (F_ap) para uma verificação do equilíbrio de endogamia (Wright) da população, o qual foi calculado pela seguinte expressão:

Resultados e Discussão

Das bandas obtidas com os oito primers, 56 foram analisadas, obtendo-se 78,57% de polimorfismo para todas as populações. Dentro de cada população, a taxa de polimorfismo foi menor que 60% (Figura 1). Estes resultados demonstram haver variabilidade genética para a espécie. A Figura 2 mostra o padrão de bandas amplificadas com o primer OP-D11, para quatro populações.

O agrupamento genético das populações resultou em dois grupos (Figura 3), correspondentes às duas regiões geopolíticas do Vale do Rio Acre: o Alto Acre e o Baixo Acre. Houve, também, uma tendência de as populações se agruparem de acordo com suas localizações geográficas, evidenciando certa estruturação espacial da variabilidade genética. A análise da correlação entre as distâncias genéticas e geográficas de cada par de populações foi altamente significativa (r = 0,77; p<0,001), confirmando esta estruturação (Figura 4).

A maior parte da variação genética total de P. hispidinervum está dentro das populações (Tabela 2), e cerca de 28% dessa variação foi detectada entre populações.

A estrutura genética determinada por meio das estimativas das freqüências alélicas, pressupondo equilíbrio de Hardy-Weimberg, foi semelhante àquela definida pela AMOVA, com uma menor diferenciação entre regiões. Embora a metodologia baseada na análise de marcadores dominantes possa causar sérios vieses nas estimativas de parâmetros genéticos populacionais, os resultados foram consistentes. Alguns trabalhos, com outras espécies vegetais, demonstraram que marcadores dominantes (RAPD) e co-dominantes (isoenzimáticos) podem gerar níveis de diversidade e diferenciação entre populações similares (Bucci et al., 1997; Ayres & Ryan, 1999).

A taxa de polimorfismo observada em cada uma das regiões (Alto e Baixo Acre) foi equivalente. Por outro lado, analisando-se as freqüências dos marcadores RAPD, observa-se que as duas regiões apresentam distribuição diferenciada dessas freqüências (Figura 5).

A dispersão de sementes de P. hispidinervum é feita principalmente por morcegos, podendo iniciar populações com base genética restrita caso ocorram poucos episódios de dispersão (Fleming & Heithaus, 1981; Hamrick & Loveless, 1986). Neste estudo, é provável que a diferenciação genética observada entre as populações e regiões ocorra em virtude do efeito fundador, isto é, populações originadas por um conjunto de sementes com características genéticas semelhantes entre si, mas diferentes dos outros conjuntos.

Heywood & Fleming (1986) também verificaram diferenciação genética entre populações, para três espécies de Piper, na Costa Rica, onde a dispersão de sementes é feita exclusivamente por morcegos. Como P. hispidinervum é uma espécie pioneira que coloniza rapidamente grandes áreas, gerando populações densas com banco de sementes restrito, cuja a germinação é muito dependente de luz, a sobreposição de gerações no banco de sementes deve ser pequena, contribuindo para certa homogeneidade da população e conseqüente diferenciação entre populações.

Resultados similares aos deste estudo foram observados para a espécie Piper cernnun (Mariot, 2000), em que a diferenciação genética entre quatro populações da Mata Atlântica foi elevada (F_ST = 0,29), com forte estruturação espacial.

Trabalhos semelhantes, conduzidos com outras espécies de plantas pioneiras de fecundação cruzada (Alvarez-Buylla & Garay, 1994; Keys & Smith, 1994), demonstram valores de F_ST menores. Uma hipótese a ser testada para explicar esses dois padrões estaria relacionada às diferentes dinâmicas de extinção e recolonização, associadas com o tipo de banco de sementes no solo. O banco de sementes permanente favorece a sobreposição de gerações, minimizando o efeito fundador, enquanto este efeito é mais pronunciado quando o banco de sementes é restrito.

As estimativas de tm e ts foram 1,033 e 1,139, respectivamente, mostrando que a população estudada é predominantemente alógama. A diferença tm - ts foi -0,096, indicando que os cruzamentos ocorrem preferencialmente entre indivíduos não-aparentados. O coeficiente de endogamia F foi 0,05, evidenciando uma condição de panmixia da população, ou seja, os cruzamentos são aleatórios. O modo de reprodução por cruzamento foi bastante consistente de família para família.

A população amostrada apresentou freqüências genotípicas (estimadas a partir dos dados das progênies) semelhantes às esperadas para o equilíbrio de Hardy-Weinberg.

O gênero Piper contém mais de 700 espécies distribuídas em regiões tropicais e subtropicais do mundo inteiro, em que têm sido constatadas tanto espécies autógamas como alógamas. Apenas três espécies de Piper foram estudadas quanto à auto-incompatibilidade, P. methysticum se mostrou auto-incompatível (Prakash et al., 1994) e P. nigrum e P. arieianum são autocompatíveis (Martin & Gregory, 1962; Marquis, 1988).

Estudos sobre a produção de sementes em plantas isoladas ou infrutescências ensacadas de P. hispidinervum (Silva & Oliveira, 2000) evidenciaram a presença de mecanismo biológico que evita a autofecundação. Este trabalho mostrou essa mesma tendência, evidenciando que existe uma preferência para cruzamento entre indivíduos não-aparentados. Características biológicas particulares de P. hispidinervum podem sugerir uma possível auto-incompatibilidade.

Conclusões

1. A espécie Piper hispidinervum apresenta estrutura genética que se enquadra no modelo de isolamento por distância.

2. Piper hispidinervum é, preferencialmente, de fecundação cruzada.

Agradecimentos

Ao DFID (Department for International Development) pelo apoio financeiro; ao técnico agrícola Rubens Mamedio Barros pelo apoio durante as coletas de campo; aos técnicos do Laboratório de Reprodução e Genética de Espécies Arbóreas (LARGEA) da USP-ESALQ pelas condições oferecidas durante as análises de RAPD.

Recebido em 26 de fevereiro de 2003 e aprovado em 4 de novembro de 2003

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  21 Maio 2004
• Data do Fascículo
  Fev 2004

Histórico

• Aceito
  04 Nov 2003
• Recebido
  26 Fev 2003