Eliminação de resistência a drogas por fluorquinolonas em Staphylococcus aureus de origem bovina

Elimination of resistance to drugs by fluoroquinolones in bovine strains of Staphylococcus aureus

Eliminação de resistência a drogas por fluorquinolonas em Staphylococcus aureus de origem bovina

Elimination of resistance to drugs by fluoroquinolones in bovine strains of Staphylococcus aureus

Maria S.V. Pereira^I,II; José P. Siqueira Júnior^I; Galba M. Campos Takaki^II,III

^IDepto Biologia Molecular, Centro de Ciências Exatas e da Natureza, Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa, PB 58059-900. E-mail: [e-mail]

^IILaboratório de Imunopatologia "Keizo Asami", Universidade Federal de Pernambuco, Recife, PE

^IIINúcleo de Pesquisas em Ciências Ambientais, Departamento de Química, Universidade Católica de Pernambuco, Recife, PE

RESUMO

Cepas de Staphylococcus aureus de origem bovina foram submetidas ao tratamento com quatro fluoquinolonas na concentração subinibitória (1/2 x CMI), para avaliar a influência desses agentes sobre plasmídios. A ciprofloxacina mostrou ser a fluorquinolona mais eficiente, eliminando marcas de resistência para estreptomicina, tetraciclina, penicilina e cádmio. A norfloxacina e a pefloxacina eliminaram resistência para penicilina e tetraciclina, respectivamente; no entanto, não foi evidenciada a eliminação de plasmídio com ofloxacina. Os resultados confirmam a eficácia das fluor-quinolonas em eliminar plasmídios de resistência mostrando a importância desses estudos como contribuição para o entendimento da prevenção de linhagens multiresistentes, uma vez que as quinolonas em concentrações subinibitórias podem aumentar a sensibilidade das linhagens a outros agentes antimicrobianos.

Termos de indexação: Staphylococcus aureus, fluorquinolonas, eliminação de resistência a drogas.

ABSTRACT

Bovine strains of Staphylococcus aureus were submitted to treatment with four fluoro-quinolones in subinhibitory concentrations (1/2 x MICs) to evaluate their influence on the curing of plasmids. Ciprofloxacin showed to be the most efficient by eliminating resistance to streptomycin, tetracyclin, penicillin, and cadmium nitrate. Norfloxacin and pefloxacin eliminated penicillin- and tetracyclin-resistance respectively. Otherwise, plasmids elimination by ofloxacin was not evidenced. The results obtained in this study confirm the potential of fluoroquinolones to eliminate antibiotic-resistant plasmids, and showed to be a valuable contribution for the prevention of multi-resistant strains, and may even enhance their sensitivity to other chemotherapeutic agents.

Index terms:Staphylococcus aureus, fluoroquinolones, elimination of resistance to drugs.

INTRODUÇÃO

As fluorquinolonas representam uma das melhores classes de agentes antimicrobianos que são utilizados em medicina humana e veterinária, no tratamento de uma variedade de infecções bacterianas. O considerável sucesso desses produtos sintéticos pode ser atribuído ao seu amplo espectro de atividade, toxidade mínima sobre eucariotos, fácil penetração na maioria das células bacterianas e boas propriedades farmacocinéticas (Brown 1996, Couturier et al. 1998, Blondeau 1999).

Todas as quinolonas agem por inibição da atividade da enzima alvo, DNA girase, uma topossomerase tipo II, responsável primariamente pela introdução da superhelicoidização negativa do DNA, na presença de ATP; essas alterações no estado topológico do DNA desempenham funções nos processos de replicação, transcrição, recombinação e reparação celular (Takenouchi et al. 1995, Zhanel et al. 1995).

Além da vasta resistência aos mais diversos antibióticos, o Staphylococcus aureus pode ainda apresentar resistência a íons metálicos (arsenato, cádmio, mercúrio) e a biocidas tais como acriflavina, cloreto de benzalcônio, cetrimida e clorexidina. A seleção e manutenção dessas marcas de resistência se explica pela presença destes agentes, como poluentes urbanos ou industriais, ou mesmo de uso hospitalar como antisséptico (Foster 1983, Russel 1997).

A multiresistência em S. aureus resulta da presença de plasmídios, geralmente em múltiplas cópias, o que garante não somente a sua distribuição durante a divisão celular, mas principalmente permite a transferência em freqüência mais elevada (Lacey & Chopra 1974), sem causar na maioria das vezes um custo biológico para a célula bacteriana. Embora em amostras bovinas a resistência múltipla não seja muito freqüente, o envolvimento de plasmídios de resistência a antibióticos e íons metálicos tem sido demonstrado (Pereira & Siqueira 1995).

Uma variedade de compostos tais como corantes de acridina, brometo de etidio, rifampicina, sal de bis-amônio e mais recentemente a tioridazina, uma fenotiazina, assim como antibióticos inibidores da subunidade B da DNA girase, novobiocina e coumermicina tem sido reportada para eliminar plasmídios (Weisser & Wiedmann 1985, Fu et al. 1988, Radhakrishnan et al. 1999). No entanto, são raros os relatos da cura de plasmídios por inibidores da subunidade A da DNA girase, particularmente em linhagens de S. aureus de origem animal.

O presente estudo compara a influência de quatro fluorquinolonas, ciprofloxacina, norfloxacina, ofloxacina e pefloxacina na eliminação de plasmídios de resistência a antibióticos e ao cádmio, em amostras de S. aureus de origem bovina.

MATERIAL E MÉTODOS

Cepas bacterianas. As três cepas de Staphylococcus aureus utilizadas nesse estudo foram provenientes de bovinos em fase de lactação, apresentaram plasmídios de resistência a antibióticos e íons cádmio, demonstrados anteriormente por brometo de etidio e confirmadas por eletroforese em gel de agarose (Pereira & Siqueira 1995).

Tratamento por fluorquinolonas. Todas as cepas foram cultivadas em caldo BHI (Brain Heart Infusion, Difco), a 37°C por 18 a 24 horas e diluídas 100 vezes no mesmo meio adicionado da concentração subinibitória (1/2 x concentração inibitória mínima) de cada fluorquinolona ensaiada. Após incubação a 37°C por 24 horas, sob agitação, as culturas foram convenientemente diluídas em solução salina esterilizada (cloreto de sódio 0,85%) e alíquotas de 0,1mL foram semeadas em BAB (Blood Agar Base, Difco) para a determinação do título. A perda de resistência a drogas foi determinada por réplica (Ledeberg & Ledeberg 1952) em BAB acrescido de cada droga em estudo, numa concentração que permitia o desenvolvimento de colônias resistentes. A freqüência da eliminação foi calculada como a percentagem de colônias sensíveis a drogas sobre o total de colônias ensaiadas (no mínimo 450 colônias ensaiadas em cada experimento; as cepas sensíveis aos antibióticos e íons cádmio obtidas foram selecionadas e a concentração inibitória mínima foi determinada. Experimentos controles para a determinação de eliminação espontânea de plasmídios foram realizados simultaneamente; as cepas foram cultivadas em caldo BHI (Brain Heart Infusion, Difco), a 37°C por 18 a 24 horas e diluídas 100 vezes no mesmo meio, na ausência de cada uma das fluorquinolonas ensaiadas.

Para a determinação da concentração inibitória mínima (CIM), uma série de placas foram preparadas, usando-se concentrações crescentes e dobradas das drogas que variaram de 0,015625 a 512mg da droga por ml em um volume final de 20mL de meio de cultivo (BAB). As cepas foram cultivadas em BHI a 37°C, por 18 a 24 horas, diluídas (10^-2) em solução salina e assim inoculadas (10⁴ UFC/ml) nas placas com auxílio de uma multialça. As placas foram incubadas a 37°C por 18 a 24 horas e foi considerada como CIM a menor concentração da droga que inibiu completamente o crescimento bacteriano. A linhagem ATCC 29213 (National Committee for Clinical Laboratory Standard 1988), foi utilizada como controle de referência.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Em estudos preliminares evidenciou-se a presença de plasmídios de resistência a penicilina, cádmio, estreptomicina e tetraciclina, em 18 amostras de Staphylococcus aureus de origem bovina (Pereira & Siqueira 1995); destas, três cepas representativas portadoras de plasmídios com marcas de resistência para antibióticos e cádmio foram selecionadas para o presente estudo (Quadro 1).

Em geral, todas as fluorquinolonas ensaiadas neste estudo foram ativas sobre as amostras de S. aureus (ciprofloxacina CMI <2mg/mL; norfloxacina <4mg/mL; ofloxacina <1mg/mL e pefloxacina <2mg/mL). Os resultados de eliminação de plasmídios por fluorquinolonas são apresentados no Quadro 2.

Ciprofloxacina mostrou ser a fluorquinolona mais eficiente, eliminando resistência para estreptomicina, tetraciclina, penicilina e cádmio nas amostras 233FN e 319U, respectivamente. Interessante observar que na cepa 233FN, foi evidenciada a eliminação de resistência à estreptomicina numa freqüência de 4,22% e tetraciclina numa freqüência de 13,1%; também foi observada eliminação simultânea numa freqüência de 1,48%, o que indica que essas marcas de resistência se encontram em plasmídios diferentes. Na cepa 319U, foi evidenciada a eliminação simultânea de resistência à penicilina e cádmio, o que sugere a existência de um único plasmídio, codificando ambas propriedades fenotípicas.

A norfloxacina eliminou resistência à penicilina somente na cepa 223U (0,49%), dados estes concordantes com os de Weisser & Wiedmann, (1985), que evidenciaram eliminação de plasmídios por norfloxacina; no entanto, esses dados são contrastantes com os relatos de Fu et al. (1988) que não observaram cura de plasmídio com norfloxacina e ácido nalidíxico. A pefloxacina eliminou somente resistência à tetraciclina na amostra 233FN.

No entanto, não foi evidenciada a eliminação de plasmídio com ofloxacina, dados estes contrastantes com os de Weisser & Wiedmann (1985) e Fu et al. (1988); essa flutuação das fluorquinolonas na eliminação de plasmídios pode refletir uma peculiaridade da linhagem em estudo (Lacey & Chopra 1974). Em culturas controles não foram observadas a perda espontânea de plasmídios nas linhagens ensaiadas, com exceção para a marca de resistência à estreptomicina na cepa 233FN, cuja freqüência de eliminação foi de 0,83%, inferior à observada por ciprofloxacina (4,22%), única fluorquinolona que eliminou esta marca.

A resistência a íons metálicos em linhagens de S. aureus de origem animal apresenta um padrão de resistência diferente em relação aos isolados clínicos hospitalares (Lacey & Chopra 1974). Em nossa região, cepas de S. aureus exibiram baixa freqüência de resistência ao mercúrio e alta freqüência de resistência ao arsenato, enquanto linhagens clínicas hospitalares demonstraram alta freqüência de resistência ao mercúrio associada com resistência ao cádmio, e baixa freqüência de resistência ao arsenato (Pereira & Siqueira 1995). A resistência ao cádmio em cepas bovinas tratadas anteriormente com brometo de etidio e nas três linhagens aqui selecionadas, indicam que essa resistência pode ou não estar localizada no plasmídio penicilinase ou mesmo ter localização cromossômica (Witte et al. 1986, Pereira & Siqueira 1995).

Para a confirmação da eliminação de plasmídios de resistência a antibióticos e íons cádmio, foi realizada a confirmação em placas com antibióticos e em seguida a determinação da concentração inibitória mínima (Quadro 2).

Em geral, a capacidade de compostos para eliminar plasmídios de S. aureus, tais como SDS (dodecil sulfato de sódio), acriflavina ou acridina laranja, são muito tóxicas para o uso terapêutico. No entanto, Cuevas (1988) demonstrou a eliminação de plasmídios penicilinase em S. aureus, após tratamento com ácido ascórbico, um composto não tóxico,.

A eliminação de resistência a antibióticos in vivo em S. aureus tem sido observada a décadas, e pode desempenhar um papel importante na conduta de antibioticoterapia, uma vez que o efeito antiplasmidial é exercido não somente sobre a resistência a antibióticos, mas sobre plasmídios metabólicos e de virulência; a terapêutica com ciprofloxacina oral, por exemplo, induziu à cura de plamídio in vivo em Serratia marcescens multiresistentes (Molnár et al. 1992). Em Escherichia coli, curas semelhantes têm sido também reportadas (Lewin et al. 1991). A eliminação de plasmídios de resistência in vitro e in vivo, por quinolonas, novobiocina e coumermicina foi relatada em linhagens de E. coli, Bacillus subtilis e S. aureus (Fu et al. 1988).

A atividade antiplasmidial foi estudada em compostos triciclícos, tais como fenotiazinas e dibenzoazepinas sobre a E. coli, podendo ser devida ao aumento da permeabilidade da membrana. Um efeito sinérgico foi observado pela associação de novobiocina com esses compostos: a inibição da DNA girase e formação de um complexo com a forma superenovelada do DNA plasmidial, que pode levar à interrupção de replicação do plasmídio nas células bacterianas (Molnár et al. 1992).

Os resultados, quando comparados aos estudos anteriores utilizando um agente de cura clássico, o brometo de etidio, em amostras de S. aureus bovinas, sugerem a existência de um plasmídio para resistência à penicilina e cádmio na cepa 319U, o que não havia sido visto com o brometo de etídio. Na cepa 223U foi confirmado com norfloxacina um plasmídio para resistência a penicilina; no entanto, na amostra 233FN foi evidenciado um plasmídio de resistência para estrepto-micina, o que não foi observado com o brometo de etídio (Quadro 3).

Os resultados obtidos mostram a importância do estudo de agentes antimicrobianos na eliminação de plasmídios, seja de resistência a drogas ou mesmo de virulência, o que poderá contribuir, quando associado a estudos in vivo, para a prevenção de linhagens multiresistentes. As quinolonas em concentrações subinibitórias, podem aumentar a sensibilidade das cepas bacterianas a outros agentes antimicrobianos.

Agradecimentos.- Os autores agradecem o suporte financeiro concedido pela CAPES, CNPq e PRONEX.

Recebido em 20 de julho de 2003

Aceito para publicação em 11 de outubro de 2003

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  13 Ago 2004
• Data do Fascículo
  Mar 2004

Histórico

• Recebido
  20 Jul 2003
• Aceito
  11 Out 2003