Esquema 1
a) Reações enzimáticas comumente catalisadas pelas enzimas P450. b) Hidroxilação do ácido palmítico pelo P450BM3 na posição subterminal ω−2
Esquema 2
Representação esquemática do ciclo catalítico geral das enzimas do citocromo P450 na presença de um substrato genérico (RH). As linhas pontilhadas representam vias de desacoplamento. Adaptada de Whitehouse e col. (2011)1818 Whitehouse, C. J. C.; Bell, S. G. Wong, L. L.; Chem. Soc. Rev. 2012, 41, 1218.
Figura 1
Estrutura cristalina a) geral e b) do sítio ativo do P450BM3 complexando o ácido palmitoleico (C16:1, amarelo) (código PDB: 1FAG). Interações iônicas são representadas como linhas pontilhadas
Esquema 3
Comparação da estrutura do substrato nativo com a primeira geração de moléculas-traiçoeiras. Essas moléculas possuem uma cadeia perfluoroalquílica mais curta do que substratos nativos
Figura 2
Frequência de rotatividade de hidroxilação dos substratos não nativos propano (esquerda) e cicloexano (direita) pelo P450BM3 na ausência e na presença de moléculas-traiçoeiras de comprimentos variados (barras vermelhas indicam a FR e círculos ocos roxos indicam a EA). Condições de reação: P450BM3 do tipo selvagem (0,5 μmol L-1), molécula-traiçoeira (100 μmol L-1), tampão saturado com gás propano e oxigênio (4:1) ou cicloexano (10mmolL-1), NADPH (5 mmol L-1), durante dez minutos em tampão Tris-HCl 20 mmol L-1, pH 7,4 contendo KCl (100 mmol L-1)
Esquema 4.
Comparação entre o ciclo catalítico na presença de um substrato nativo (RH) (direita) e o ciclo catalítico na presença de uma molécula-traiçoeira (MT) e o substrato não nativo cicloexano (esquerda)
Esquema 5
Esquema mostrando a evolução de moléculas-traiçoeiras de primeira geração a terceira geração. n representa o comprimento da cadeia perfluoroalquílica, sendo n = 2 correspondente ao APFG8. R1 significa um dos vinte aminoácidos canônicos. R2 significa um ácido carboxílico. Quatro exemplos de moléculas-traiçoeiras de terceira geração que possuem boas propriedades, 5CHVAPhe, SIbuPhe, C7ProPhe e ZProPhe, também são apresentadas
Figura 3
a) e b) Estruturas de raio X do P450BM3 em complexo com N-palmitoilglicina (C16Gly, laranja) (código PDB: 1JPZ); e c) e d) com N-perfluoropelargonoil-L-triptofano (APFG9Trp, rosa e branco) (código PDB: 3WSP)
Figura 4
Comparação entre o espaço no sítio ativo do P450BM3 complexando com a) o substrato C16Gly (código PDB: 1JPZ) e b) a molécula-traiçoeira de segunda geração APFG9Trp (código PDB: 3WSP). No caso de C16Gly, observa-se que F87 se encontra rotacionado de tal forma que o sítio ativo é completamente obstruído. Entretanto, no caso de APFG9Trp, há espaço suficiente para acessar o sítio ativo
Esquema 6
Reator de alta pressão baseado em pressurização de fluxo líquido (patente número 2019-69404).4444 Watanabe, Y.; Shoji, O.; Jpn. Kokai Tokkyo Koho P2019-69404A 2019. Empregando esse reator, pressões de até 10 MPa podem ser alcançadas
Esquema 7
Visão geral da evolução sistemática de moléculas-traiçoeiras dipeptídicas N-substituídas provenientes da triagem executada em seis etapas. As duas moléculas mais eficazes descobertas por esta abordagem são mostradas à direita
Esquema 8
Ilustração simplificada que apresenta a aplicação de moléculas-traiçoeiras em biocatálise com células inteiras. A bactéria E. coli geneticamente modificada, a qual expressa a enzima citocromo P450BM3 do tipo selvagem, foi cultivada em meio de cultura contendo glicose. (1) A molécula de Benzeno permeia a membrana da E. coli. (2) A molécula-traiçoeira penetra a membrana bacteriana. (3) O benzeno presente no interior da célula é hidroxilado pelo P450BM3 produzido dentro da E. coli usando NADPH como doador de elétrons. (4) O cofator NADPH é regenerado pela E. coli através do metabolismo da glicose
Esquema 9
Hidroxilação enantiodivergente na posição benzílica do indano induzida por moléculas-traiçoeiras
Figura 5
Hidroxilação do tolueno e ciclodecano pelas variantes do citocromo P450BM3, onde TS é o tipo selvagem, e KT2 (amarelo) e R19 (ciano) são mutantes do citocromo P450BM3, respectivamente. Os aminoácidos que foram submetidos a mutagênese são coloridos em ciano para KT2 e em amarelo para R19
Esquema 10
Comparação entre a ciclopropanação do estireno mediada pelo mutante duplo F87A/T268A do P450BM3 na ausência e na presença da molécula-traiçoeira RIbuPhe
Esquema 11
a) Através de um método suave, em que E. coli são cultivadas em condições limitação de ferro, para obter o domínio hémico do P450BM3 sem heme (apo-P450BM3). A metaloporfirina sintética (aqui MnPPIX) é suplementada na etapa de disrupção celular por sonicação para obter P450BM3 reconstituído. b) Utilizando a atividade de Sortase A, o domínio hémico do P450BM3 reconstituído com MnPPIX é ligado ao domínio redutase
Figura 6
a) Estrutura cristalina do domínio hémico do P450BM3 em complexo com AbiATrp com resolução de 1,22 Å (código PDB: 6JLV). O mapa de densidade eletrônica 2Fo−Fc contornado a 2,5σ (malha ciana) e o mapa Fo−Fc omitindo AbiATrp contornado a 5,0σ (malha cinza). b) Estrutura cristalina do domínio hémico do P450BM3 em complexo com C7ProPhe com resolução de 1,41 Å (código PDB: 6K58). O mapa de densidade eletrônica 2Fo−Fc contornado a 2,0σ (malha ciana) e o mapa Fo−Fc omitindo C7ProPhe contornado a 4,5σ (malha cinza). c) Estrutura cristalina do domínio hémico do P450BM3 em complexo com 3CPPAPipPhe com resolução de 1,74 Å (código PDB: 6L1B). O mapa de densidade eletrônica 2Fo−Fc contornado a 2,0σ (malha ciana) e o mapa Fo−Fc omitindo 3CPPAPipPhe contornado a 3,5σ (malha cinza). d) Estrutura cristalina do domínio hémico do P450BM3 reconstruído com MnPPIX com resolução de 3,10 Å obtida por um protocolo padrão (código PDB: 5ZIS). O mapa de densidade eletrônica 2Fo−Fc contornado a 1,0σ (malha ciana) e o mapa Fo−Fc omitindo MnPPIX contornado a 3,0σ (malha cinza). O mapa anómalo de Fourier-diferença coletado a 1,75 Å contornado a 5,0σ (malha vermelha). e) Estrutura cristalina do domínio hémico do P450BM3 reconstruído com MnPPIX ligada piridina com resolução de 1,68 Å obtida pelo novo método (código PDB: 6JZS). O mapa de densidade eletrônica 2Fo−Fc contornado a 2,5σ (malha ciana) e o mapa Fo−Fc omitindo MnPPIX contornado a 5,0σ (malha cinza). O mapa anómalo de Fourier-diferença coletado a 1,75 Å contornado a 10,0σ (malha vermelha). Interações iônicas são representadas como linhas pontilhadas
Esquema 12
Visão geral do processo de microcristalização. O domínio hémico do P450BM3 é misturado com a molécula-traiçoeira AbiATrp e é cristalizado para gerar macrocristais. Os macrocristais formados são rigorosamente macerados resultando em cristais microscópicos, os quais podem ser utilizados como cristais de semente para estimular o crescimento de outros cristais desejados do domínio hémico do P450BM3, incorporando outras moléculas-traiçoeiras, metaloporfirinas sintéticas ou até mesmo, em alguns casos, ambas
Figura 7
Estrutura cristalina a) geral e b) do sítio ativo do P450BSβ em complexo com ácido palmítico (C16, amarelo) (código PDB: 1IZO). Interações iônicas são representadas como linhas pontilhadas
Tabela 1
Comparação entre a temperatura e a pressão na hidroxilação do propano
Tabela 2
Hidroxilação do propano na presença de APFG9 em 24 horas
Tabela 3
Hidroxilação do etano e do benzeno por moléculas-traiçoeiras de primeira a terceira geração
Tabela 4
Frequência de rotatividade da hidroxilação do propano por P450BM3 na presença de moléculas-traiçoeiras
Tabela 5
Hidroxilação benzílica estereosseletiva catalisada pelo P450BM3 na ausência e presença de moléculas traiçoeiras de segunda e terceira geração