Constituintes químicos de Ottonia corcovadensis Miq. da floresta Amazônica: atribuição dos deslocamentos químicos dos átomos de hidrogênio e carbono

Chemical constituents of Ottonia corcovadensis Miq. from Amazon forest: ¹h and 13c chemical shift assignments

Resumo

In an ethanolic extract of leaves of Ottonia corcovadensis (Piperaceae) were identified sixteen terpenoids of essential oil and the three flavonoids 3',4',5,5',7-pentamethoxyflavone (1), 3',4',5,7-tetramethoxyflavone (2) and 5-hydroxy-3',4',5',7-tetramethoxyflavone (3) and cafeic acid (4). Two amides (5 and 6) were isolated from an ethanolic extract of the roots. The structures were established by spectral analysis, meanly NMR (1D and 2D) and mass spectra. Extensive NMR analysis was also used to complete ¹H and 13C chemical shift assignments of the flavonoids and amides. The components of the essential oil were identified by computer library search, retention indices and visual interpretation of mass spectra.

Ottonia corcovadensis; Piperaceae; terpenoids; flavonoids; cafeic acid; amides

Ottonia corcovadensis; Piperaceae; terpenoids; flavonoids; cafeic acid; amides

ARTIGO

Constituintes químicos de Ottonia corcovadensis Miq. da floresta Amazônica — atribuição dos deslocamentos químicos dos átomos de hidrogênio e carbono

Chemical constituents of Ottonia corcovadensis Miq. from Amazon forest — ¹h and ¹³c chemical shift assignments

Valdir A. Facundo^I; Selene M. Morais^II; Raimundo Braz FilhoIII, ^*

^IDepartamento de Química, Universidade Federal de Rondônia, Br 364, km 9,5, 78900-000 Porto Velho - RO

^IIDepartamento de Química e Física, Centro de Ciências e Tecnologia, Universidade Estadual do Ceará, Av. Paranjana 1700, 60740-000 Fortaleza - CE

^IIISetor de Química de Produtos Naturais, Laboratório de Ciências Químicas, Centro de Ciência e Tecnologia, Universidade Estadual do Norte Fluminense, Av. Alberto Lamego, 2000, 28013-600 Campos - RJ

ABSTRACT

In an ethanolic extract of leaves of Ottonia corcovadensis (Piperaceae) were identified sixteen terpenoids of essential oil and the three flavonoids 3',4',5,5',7-pentamethoxyflavone (1), 3',4',5,7-tetramethoxyflavone (2) and 5-hydroxy-3',4',5',7—tetramethoxyflavone (3) and cafeic acid (4). Two amides (5 and 6) were isolated from an ethanolic extract of the roots. The structures were established by spectral analysis, meanly NMR (1D and 2D) and mass spectra. Extensive NMR analysis was also used to complete ¹H and ¹³C chemical shift assignments of the flavonoids and amides. The components of the essential oil were identified by computer library search, retention indices and visual interpretation of mass spectra.

Keywords:Ottonia corcovadensis; Piperaceae; terpenoids; flavonoids; cafeic acid; amides.

INTRODUÇÃO

A espécie Ottonia corcovadensis Miq. (Piperaceae) é comumente encontrada no norte e nordeste do Brasil, sendo conhecida popularmente como João brandinho. No Estado do Acre, aparece como uma das principais espécies vegetais da medicina popular, onde as folhas são usadas para tratamento de reumatismo na forma de compressa e como chá para gripe e tosse¹.

Este artigo descreve o estudo químico das folhas e das raízes de um espécime de Ottonia corcovadensis coletado em Porto Velho, Rondônia, Brasil. A análise do óleo essencial das folhas permitiu a identificação de dezesseis terpenóides (Tabela 1) através de cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (CG/EM). Os flavonóides 3',4',5,5',7-pentametoxiflavona (1), 3',4',5,7-tetrametoxiflavona (2) e 5-diidroxi-3',4',5',7-tetrametoxiflavona (3) e o ácido cafeico (4) foram isolados do extrato etanólico das folhas, após a extração do óleo essencial por arraste de vapor. Do extrato etanólico das raízes foram isoladas as amidas piperovatina (5) e chingchengenamida (6). As estruturas dos flavonóides e das amidas foram estabelecidas com base na análise de dados espectrais, principalmente os obtidos de espectros de RMN ¹H e ¹³C (1D e 2D)² e de massas. A interpretação detalhada dos espectros 1D e 2D de RMN ¹H e ¹³C foi também utilizada na atribuição inequívoca dos deslocamentos químicos dos três flavonóides (Tabelas 2 e 3) e das duas amidas (Tabela 4), além de permitir reconhecer a presença de todos sinais característicos da amida piperovatina (5) nos espectros da flavona 3 (componente predominante).

No sudeste do Brasil essa planta é conhecida como falso jaborandi, sendo suas raízes e ramos mastigados para aliviar dor de dente, devido à ação anestésica sobre a membrana mucosa da boca. Investigação fitoquímica do extrato éter de petróleo das raízes de um espécime coletado na montanha do Corcovado, Rio de Janeiro, Brasil, registrou a presença de cinco amidas, piperovatina (5), piperlonguminina (7), corcovadina (8), isopiperlonguminina (9) e isocorcovadina (10). A atividade anestésica da planta foi atribuída à presença de piperovatina (5)³.

A região onde foi coletado o material de Ottonia corcovadensis para nosso estudo encontra-se inserida em condição ambiental significativamente diferente da observada na capital do Estado do Rio de Janeiro, onde foram coletadas as raízes da mesma espécie para a investigação fitoquímica anterior³.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A análise do óleo essencial através de cromatografia gasosa acoplada a espectrômetro de massas (CG/EM), pesquisa computacional em biblioteca de substâncias Hewlett — Packard, índices de retenção e interpretação visual de espectros de massas^4-6 possibilitou a identificação de dezesseis componentes (Tabela 1). Limoneno (12,74%), trans-cariofileno (13,63%), epibiciclosesquifilandreno (10,25%) e germacreno B (9,81%) destacaram-se como os componentes principais. Várias substâncias descritas como componentes dos óleos essenciais das espécies brasileiras Piper arboreum Aublet var. latifolium (CDC) e P. hispidum⁷ foram também encontrados em O. corcovadensis.

Os flavonóides 3',4',5,5',7-pentametoxiflavona (1) e 3',4',5,7-tetrametoxiflavona (2), isolados como uma mistura, foram caracterizados principalmente com base nos espectros de RMN¹H e ¹³C (Tabela 2). O espectro de RMN¹H mostrou os sinais dos átomos de hidrogênio do anel B de 1 em d_H 3,79 (s, MeO-3' e MeO-5'), 3,77 (s, MeO-4') e 6,86 (s, H-2'/H-6') e de 2 em d_H 3,80 (s, MeO-3'), 3,78 (s, MeO-4'), 7,08 (d, J=2,2 Hz, H-2'), 6,75, (d, J=8,6 Hz, H-5') e 7,26, (dd, J=2,2 e 8,6 Hz, H-6'). As informações fornecidas pelos espectros de RMN¹³C ({¹H} e DEPT135) e 2D de correlação heteronuclear (HMQC e HMBC) confirmaram estas deduções e permitiram a atribuição inequívoca dos deslocamentos químicos de todos os átomos de hidrogênio e carbono de cada uma das flavonas (1 e 2) presentes na mistura (Tabela 2). Com base nas intensidades relativas reveladas pela integração computacional dos sinais dos átomos de hidrogênio H-2'/H-6' (d_H 6,86) de 1 e H-5' (d_H 6,75) de 2 no espectro 1D de RMN¹H da mistura calculou-se as percentagens aproximadas das duas flavonas: 60,2% (1) e 39,8% (2).

A estrutura 5-hidroxi-3',4',5',7-tetrametoxiflavona (3) foi definida com base na análise dos espectros 1D e 2D de RMN¹H e ¹³C, envolvendo a comparação com dados de 2 (Tabela 2) e de RMN¹³C da 5,7-diidroxi-3',4',5'—trimetoxiflavona⁸ (Tabela 3). A atribuição inequívoca dos deslocamentos químicos dos átomos de hidrogênio e carbono de 3 baseou-se também em correlações a longa distância de carbono e hidrogênio (²J_CH e ³J_CH) observadas no espectro 2D HMBC (Tabela 3). A comparação dos dados de RMN¹³C de 3 e 5,7-diidroxi-3',4',5'-trimetoxiflavona revelou efeito g esperado do grupo metoxílico MeO-7 nos carbonos CH-6 e CH-8 (3), localizados em posição orto (Tabela 3). Após a definição estrutural da flavona 3, foi possível verificar a presença de todos os sinais característicos da amida piperovatina (5) nos 1D e 2D de RMN¹H e ¹³C. O ácido cafeico (4) foi identificado através dos dados fornecidos pelos espectros de RMN¹H e ¹³C comparados com valores descritos na literatura⁹.

As flavonas 1, 2 e 3 não foram encontradas em outras espécies dos gêneros Ottonia e Piper. O ácido cafeico (4) foi isolado de Piper nigrum. A espécie O. corcovadensis revela estreita relação botânica com espécies do gênero Piper. O número de flavonas isoladas de Piper pode ser classificado como relativamente reduzido, destacando-se flavonas tri- e tetraoxigenadas¹⁰. A 3',4',5,5,7-pentametoxiflavona (1) e a 3',4',5,7-tetrametoxiflavona (2) foram isoladas das espécies Merrillia caloxylosa (família Rutaceae), Murraya paniculata (família Rutaceae) e Bauhinia championii (família Leguminosae), e 5-hidroxi-3',4',5',7-tetrametoxiflavona (3) de Webera corymbosa¹¹.

As amidas 5 e 6, isoladas como uma mistura do extrato etanólico das raízes, foram caracterizadas através dos espectros de RMN¹H (1D e 2D ¹H-¹H-COSY), RMN¹³C ({¹H} e DEPT135), HMQC e HMBC e cromatografia gasosa acoplada a espectrômetro de massas. As amidas piperovatina (5) e chingchengenamida (6) revelaram, respectivamente, Tr =11,676 e 12,742 min no cromatograma e picos correspondentes a íons moleculares em m/z 273 (27,9%) e 301 (9,3%) nos espectros de massas (Figura 2). O pico base em m/z 173 observado no espectro de massas de 5 foi atribuído ao fragmento 5c, sendo a localização do grupo metoxila baseada também em argumentação biogenética. O espectro de massas de 6 revelou o pico base em m/z 135 (6b). A análise comparativa dos espectros de RMN¹³C ({¹H} e DEPT135) permitiu identificar os sinais de átomos de carbono quaternários, metínicos, metilênicos e metílicos para cada uma das substâncias presentes na mistura (Tabela 4). O espectro de RMN¹H mostrou sinais de grupo isobutila em d_H 0,92 (d, J=6,7 Hz, 3H-3' e 3H-4'), 1,79 (m, H-2') e 3,15 (t, 6,5 Hz, 2H-1'), revelando intensidades relativas compatíveis com a presença deste grupo nas moléculas dos dois componentes. Os espectros 1D de RMN¹H e ¹³C revelaram como diferença significativa entre as duas substâncias a presença de um anel aromático para-dissubstituído (para-metoxifenila) em 5 [sistema AA'BB' no espectro de RMN¹H: d_H 7,07 (d=8,3 Hz, H-2/H-6) e 6,84 (d=8,3 Hz, H-3/H-5), além do singleto em d_H 3,90 correspondente aos três hidrogênios do grupo metoxila; d_C 129,81 (CH-2/CH-6), 114,20 (CH-3/CH-5) e 55,49 (MeO-4) no espectro de RMN¹³C] e um metilenodioxifenila envolvido num sistema 1,3,4-trissubstituído de 6 [sistema ABX no espectro de RMN¹H: d_H 6,62 (sl, H-2), 6,84 (d=7,8 Hz, H-5) e 6,60 (dl, d=7,8 Hz, H-6), além do singleto em d_H 5,92 correspondente aos dois hidrogênios do grupo metilenodioxílico; d_C 109,02 (CH-2), 108,96 (CH-5), 121,38 (CH-6) e 100,99 (OCH₂O) no espectro de RMN¹³C], em acordo com os fragmentos 5b, 5c, 5d e 6b deduzidos da análise dos espectros de massas. A diferença adicional entre as amidas 5 e 6 foi justificada com relativa facilidade pela presença de mais um grupo metilênico (CH₂-7a) na cadeia carbônica de 6 ([M]^•+ 301), confirmada pelo espectro HMQC através da correlação heteronuclear indicando a interação do sinal em d_C 35,16 (CH₂-7 e CH₂-7a) com os sinais em d_H 2,66 (t, 2H-7) e 2,42 (q, 2H-7a). O carbono metilênico CH₂-7 (d_C 38,48) de 5 apareceu claramente correlacionado com o sinal em d_H 3,42 (d, J=6,1 Hz, 2H-7). O espectro 2D ¹H-¹H-COSY revelou com clareza as interações spin-spin dos átomos de hidrogênio 2H-7a (d_H 2,42, t, J=7,4 Hz) com os 2H-7 (d_H 2,66, q, J=7,4 Hz) e o H-8 (d_H 6,17, s) da amida 6. O maior d_H dos hidrogênios 2H-7 (d_H 3,42) de 5 pode ser justificado pela sua localização em posição recebendo a influência dos efeitos anisotrópicos do grupo arila e da ligação dupla (diretamente ligados ao CH₂-7), enquanto os 2H-7 (d_H 2,66) sentem efeito anisotrópico do grupo arila (maior efeito anisotrópico) e 2H-7a (d_H 2,42) de 6 da ligação dupla (menor efeito anisotrópico). Outras correlações diretas de carbono e hidrogênio (¹J_CH) observadas no espectro HMQC e a longa distância (²J_CH e ³J_CH) no HMBC encontram-se resumidas na Tabela 4, contendo a completa atribuição dos deslocamentos dos átomos de carbono e hidrogênio de cada uma das duas amidas (5 e 6). Com base na intensidade relativa do sinal dos átomos de hidrogênio do grupo OCH₂O (d_H 5,92) de 6 e do H-2/H-6 (d_H 7,07) de 5 foi possível calcular as percentagens aproximadas das duas isobutilamidas presentes na mistura: 54,7% de 6 e 45,3% de 5. Após a atribuição inequívoca dos d_C e d_H de 5 e 6, verificou-se que a piperovatina (5) e a chinchengenamida (6) foram isoladas recentemente também de Piper piscatoru e P. falconare (família Piperaceae)^12,13, tornando-se possível a análise comparativa dos dados de RMN¹H (400 MHz) e ¹³C (100 MHz) com os valores descritos na literatura para as duas amidas (CDCl₃). As pequenas diferenças verificadas classificam-se na faixa do erro experimental, considerando-se também a obtenção dos nossos espectros em aparelho de mais alta resolução [500 (¹H) e 125 (¹³C) MHz]. Os dados descritos na Tabela 4 servem também para confirmação dos valores da literatura^12,13, já que a nossa análise inclui resultados obtidos de experiências bidimensionais (2D) de correlação homonuclear (¹H-¹H-COSY) e heteronuclear [¹H-¹³C-COSY-ⁿJ_CH (n=1, HMQC; n=2 e 3, HMBC)].

PARTE EXPERIMENTAL

Procedimentos experimentais gerais

Os espectros de RMN foram obtidos nos aparelhos Bruker - Avance 500 (¹H: 500 MHz; ¹³C: 125 MHz) e Jeol — 400 (¹H: 400 MHz; ¹³C: 100 MHz). Os espectros 1D de RMN¹H e RMN¹³C foram obtidos em condições padronizadas (detecção direta DUAL-¹H/¹³C 5 mm); as experiências 2D foram acumuladas e processadas em um computador Aspectx32 com sofware da Bruker; seqüências padronizadas de pulso foram usadas para os espectros ¹H-¹H-COSY (PO 45º, SW 8000 Hz, 1K x 128 aquisições e 1K x 512 no processamento); para a experiência homonuclear 2D ¹H-¹H-NOESY o programa NOESYTP (tempo de mixing 650 ms e intervalo de relaxamento 3 s) foi utilizado após a solução ser borbulhada com N₂; espectros de correlação heteronuclear 2D ¹H-¹³C-HMQC-¹J_CH e ¹H-¹³C-HMBC-ⁿJ_CH (n=2 e 3) foram obtidos com o programa INVBTP (¹J_CH = 145 Hz, f₂ 30118 Hz e f₁ 8012 Hz, intervalo de relaxamento 2 s) e (MJ 52 ms, ⁿJ_CH = 7 Hz^,, f₂ 3020 Hz e f₁ 8012 Hz, intervalo de relaxamento 2 s). Os espectros de massas foram registrados por impacto eletrônico (70 eV) em um aparelho GC/MS Hewlett — Packard 5971 usando coluna capilar (30 m x 0,25 mm) dimetilpolisiloxano BD-1, He como gás de arraste e as temperaturas de 250 ºC no injetor, 200 ºC no detector e variação de 1º/min entre 35 -180 ºC e 10 ºC/min entre 180 — 250 ºC na coluna. Nas separações cromatográficas em coluna usou-se sílica gel da Aldrich ou Merck com granulação adequada. As placas cromatográficas foram reveladas com luz UV (l_max 254 nm), vapores de iodo e/ou solução alcoólica de vanilina e ácido sulfúrico.

Planta

O material vegetal foi coletado no sítio dos nove vegetais em Porto Velho, Rondônia, Brasil. A identificação botânica foi realizada no Jardim Botânico do Rio de Janeiro. Uma exsicata da espécie encontra-se depositada no herbário da Universidade Federal de Rondônia, Rondônia, Brasil, sob o número 032.

Extração e separação

O óleo essencial das folhas (500 g) de O. corcovadensis foi obtido por arraste de vapor d'água, fornecendo um óleo incolor com rendimento de 1,2%. As folhas (500 g) usadas para extração do óleo essencial foram submetidas a secagem numa temperatura entre 60 e 70 ºC e extraídas com etanol na temperatura ambiente durante três dias. Destilação do etanol sob vácuo forneceu 26 g de material. Este material foi misturado com sílica gel (100 g), colocado em coluna cromatográfica e eluído sob pressão reduzida com hexano, clorofórmio, acetato de etila e metanol. A fração clorofórmica foi tratada com uma mistura de MeOH e H₂O (90:10) e mantida num refrigerador durante uma noite para eliminar principalmente a clorofila. O material praticamente livre de clorofila foi seco e cromatografado em coluna de sílica gel usando como eluentes hexano e clorofórmio em misturas de polaridade crescente, obtendo-se uma mistura dos flavonóides 1 + 2 e 3. O ácido cafeico (4) foi isolado do extrato acetato de etila através de cromatografia em coluna de sílica gel usando como eluente hexano e clorofórmio em misturas de polaridade crescente.

As raízes secas e moídas (650 g) foram extraídas com etanol a temperatura ambiente durante quatro dias (2 x 3 l). A destilação do solvente sob pressão reduzida forneceu 13 g de extrato. 9 g deste extrato foram adsorvidas em 25 g de sílica gel, a mistura obtida foi colocada sobre papel de filtro num funil de Buchner adaptado num kitazato e sob pressão reduzida eluiu-se com hexano, clorofórmio, acetato de etila e metanol. O material obtido da solução clorofórmica (2 g) forneceu a mistura das duas isobutilamidas 5 e 6 após ser submetido a cromatografia em coluna de sílica gel, usando-se como eluentes misturas de hexano e clorofórmio em polaridade crescente.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem ao CNPq, BASA, FUNCAP e FAPERJ pelas bolsas e apoios financeiros concedidos, ao PADETEC (Parque de Desenvolvimento Tecnológico do Ceará) pela obtenção dos GC/MS, ao CENAUREMN (Centro Nordestino de Aplicação e Uso da ressonância magnética Nuclear) pelos espectros de RMN 1D e 2D e ao Dr. E. F. Guimarães, Museu Nacional do Rio de Janeiro, Brasil, pela identificação da planta.

Recebido em 22/4/03; aceito em 1/8/03

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  09 Mar 2004
• Data do Fascículo
  Fev 2004

Histórico

• Recebido
  22 Abr 2003
• Aceito
  01 Ago 2003