Figura 1
Evolução dos estudos visando à aplicação de poros no desenvolvimento de ferramentas analíticas. O counter Coulter foi o primeiro dispositivo prático baseado em um microporo empregado para contagem de partículas de dimensões micrométricas. A primeira demonstração experimental do fluxo de íons através de um poro como uma “entidade molecular” inserida em uma bicamada lipídica ocorreu com o antibiótico peptídico gramicidina, uma vez que este poro é formado a partir de duas moléculas isoladas, uma em cada monocamada lipídica, que ao se acoplarem adquirem a funcionalidade de via de permeação à íons. Na década de 80 ocorreu não somente a descoberta do gene da alfatoxina, bem como os primeiros experimentos demonstrando sua atividade formadora de poros em biomembranas e em bicamadas lipídicas artificiais. No ínicio da década de 90 foi mensurado o valor do diâmetro do nanoporo da alfatoxina. A elucidação da estrutura cristalográfica da alfatoxina na metade da década de 90, foi decisiva para corroborar algumas observações experimentais da ação hemolítica da alfatoxina. Neste mesmo período demonstrou-se pioneiramente que o nanoporo da alfatoxina é permeável e apenas detecta DNA de fita simples. Esta descoberta juntamente com a demonstração eletrofisiológica da aglomeração de sete subunidades proteicas para formação do nanoporo da alfatoxina impulsionaram significativamente a partir do ano 2000, a utilização desse nanoporo como elemento sensor para detecção de outros espécimes químicos, e além disso se introduziu a terminologia molecular counter Coulter, sensoriamento estocástico, sensores estocásticos. Em 2006 realizou-se a produção de alfatoxina mutante, portanto, ocorre a primeira melhoria genética no nanoporo da alfatoxina, a qual permitiu sua utilização como ferramenta para discriminação de moléculas enantioméricas. Neste mesmo ano demonstrou-se que o aumento da força iônica torna máxima a interação polietilenoglicol(PEG)-nanoporo e favorece o particionamento deste polímero no lume aquoso do nanoporo, propiciando melhorias na capacidade de detecção do nanoporo da alfatoxina; resultando no ano seguinte com a primeira demonstração deste nanoporo como espectrômetro de massa. Em 2008 demonstrou-se que o aumento na concentração de um mesmo sal (KCl de 1 mol L-1 para 4 mol L-1) aumenta em aproximadamente 200 vezes a sensibilidade do nanoporo da alfatoxina. Três anos depois se corroborou que não somente o aumento de concentração do sal, bem como a composição da solução iônica, influenciam na sensibilidade do nanoporo; com a demonstração que os sais da série de Hofmeister, especificamente a substituição do KI pelo KF aumentou em aproximadamente 100 vezes a sensibilidade do nanoporo da alfatoxina. A partir de 2010 diversos relatos demonstram academicamente que o nanoporo da alfatoxina pode ser usado para detectar armas químicas, drogas ilícitas, cianotoxinas, porém, somente no final de 2012 ocorre o primeiro anúncio comercial de um sequenciador de DNA baseado neste nanoporo. Devido aos relevantes resultados obtidos na última década propiciaram nos últimos três anos a utilização de simulação de dinâmica molecular para aumentar o entendimento da interação analito-nanoporo da alfatoxina
Figura 2
Modelo do nanoporo formado pela alfatoxina. A direita visão superior com cada subunidade representada em diferentes cores. A esquerda visão lateral com cada domínio representado em três cores. Na área central, os retângulos empilhados em três cores específicas correspondem a espessura aproximada de cada domínio. A região troncular se insere completamente na membrana lipídica, e fica posicionada com a entrada convencionalmente denominada TRANS no mesmo plano da superfície da membrana. A região copal não se insere na membrana lipídica e a entrada CIS do nanoporo fica distante (∼50 Å) da superfície da membrana. A região anelar (parte inferior da copa) fica ancorada na membrana. As barras verticais indicam o comprimento de cada região e o diâmetro do nanoporo. Adaptado do Protein Data Bank (pdb), código 7AHL
Figura 3
Esquema da montagem experimental do nanoporo da alfatoxina como biossensor estocástico. (A) Desenho da câmara experimental formada por duas hemicâmaras separadas por uma película de Teflon®com um orifício (aproximadamente 40 µm de diâmetro) para a formação da bicamada lipídica plana. (B) Primeira etapa de montagem da monocamada lipídica ocorre com acréscimo de mais solução em um dos compartimentos da câmara experimental. (C) Montagem da segunda monocamada lipídica. A deposição de cada uma das monocamadas lipídicas ocorre com a introdução de mais solução em cada um dos respectivos compartimentos da câmara. Na região central demonstra-se a mesa de amortecimento com a câmara experimental acoplada através de eletrodos à interface eletrônica de aquisição dos registros de corrente iônica. Esta interface é composta por amplificador e filtro passa-baixa conectados ao conversor analógico-digital acoplado a um microcomputador. Na parte inferior encontra-se um quadro da membrana lipídica com um único nanoporo inserido. A entrada e passagem da molécula de analitos (bolinha vermelha) através do nanoporo induzem bloqueios característicos na corrente iônica. A análise das amplitudes e durações dos bloqueios permite a identificação dos analitos; a análise da frequência dos bloqueios permite a quantificação dos analitos. A aquisição, armazenamento e análise das séries temporais (impressão digital) são processadas por um programa dedicado e a identificação do analito é realizada por comparação em um banco de dados de impressões digitais. Este banco de dados é montado com a calibração do sistema e registro de corrente iônica com analitos de alto grau de pureza
Figura 4
Influência da concentração e composição da solução na sensibilidade do nanoporo da alfatoxina. A) O valor da concentração do polietilenoglicol (PEG 2000) é menor (0,7 µmol L-1) na presença da solução iônica de elevada concentração de KCl (4 mol L-1), portanto, o aumento da concentração do KCl de 1 para 4 mol L-1, aumentou a sensibilidade do nanoporo em aproximadamente 214 vezes. Adaptado da Ref. 98. B) O valor da concentração do polietilenoglicol (PEG 1294) é menor (0,05 µmol L-1) na presença da solução iônica de fluoreto de potássio (4 mol L-1), portanto, a substituição do iodeto pelo fluoreto aumentou a sensibilidade do nanoporo em aproximadamente 130 vezes. As setas horizontais indicam o menor valor de concentração do analito (PEG), considerando a frequência dos bloqueios na corrente iônica, maior ou igual a 1 Hz como indicado pela linha vertical. Adaptado da Ref. 100
Figura 5
Capacidade do nanoporo da alfatoxina em detectar íons divalentes. (A) Representação esquemática do sítio de ligação introduzido por mutação no interior do nanoporo da alfatoxina. As setas indicam a interação de um íon (círculo cheio ou vazio) com o sítio de ligação. (B) Registros de bloqueios da corrente iônica, característicos de cada íon (Zn+2, Co+2, Cd+2). Cada registro resulta de um experimento em que apenas um dos íons foi adicionado à solução eletrolítica. (C) Registros da corrente iônica na presença de apenas íons de Co+2 na solução eletrolítica (primeiro traçado). Os três traçados inferiores representam sequencialmente os registros da corrente iônica à medida que se aumentou a concentração do Zn+2 para 35, 110 e 231 nmol L-1, respectivamente. As linhas cheias e tracejadas indicam o perfil de bloqueio na corrente, característico do Co+2 ou Zn+2, respectivamente. Adaptado da Ref. 25
Figura 6
Capacidade do nanoporo da alfatoxina na discriminação de moléculas enantioméricas. A β-ciclodextrina (βCD) foi acoplada na região mais estreita do nanoporo da alfatoxina mutante, diminuindo ainda mais seu diâmetro, portanto, reduz a corrente iônica que passa através do nanoporo como indicado pela linha contínua nos registros. a) Registro dos bloqueios na corrente iônica característica do (S)-ibuprofeno. A linha tracejada indica a amplitude dos bloqueios; b) Registro dos bloqueios na corrente iônica característica do (R)-ibuprofeno; c) Registro dos bloqueios da corrente iônica de ambas as formas enantioméricas do ibuprofeno. Ao lado direito de cada registro, os respectivos histogramas de amplitude dos bloqueios da corrente iônica. Nota-se claramente que o nanoporo é capaz de discriminar as formas enantioméricas do ibuprofeno. Adaptado da Ref. 27
Figura 7
Nanoporo da alfatoxina como espectrômetro de massas. Espectro de massa (superior) para o polietilenoglicol (PEG 1500, Mr=1500 g/mol) polidisperso obtido com o nanoporo unitário comparado ao espectro de massa (inferior) obtido pelo MALDI-TOF. Os histogramas representam o valor médio da corrente para cada amplitude de bloqueio referente a cada molécula do polímero. Os números na parte superior em cada “pico” do histograma indicam a quantidade de monômeros do etilenoglicol em cada molécula do polímero. Os maiores valores de I/Iopencorrespondem às moléculas de PEG de menor massa molecular. O I indica o valor de corrente iônica através do nanoporo quando este é ocupado pelo polietilenoglicol, e Iopen é o valor de corrente quando não há moléculas de PEG no interior do nanoporo da alfatoxina. O “pico” indicado pelo número 28 corresponde a análise da amostra de polietilenoglicol (PEG 1294) monodisperso. No MALDI-MS devido ao processo de desorção e ionização, cada molécula do PEG perde um O ou OH. Adaptado da Ref. 18
Figura 8
Nanoporo da alfatoxina como sequenciador de DNA. Representação esquemática do padrão de bloqueios na corrente iônica através do nanoporo da alfatoxina durante a translocação de ss-DNA. Observe que a amplitude dos bloqueios indicados pelas faixas coloridas é característica de cada base nucleotídica, representadas por: T=timina, A=adenina, C=citosina, G=guanina. Adaptado da Ref. 2
Figura 3
Esquema da montagem experimental do nanoporo da alfatoxina como biossensor estocástico. (A) Desenho da câmara experimental formada por duas hemicâmaras separadas por uma película de Teflon®com um orifício (aproximadamente 40 µm de diâmetro) para a formação da bicamada lipídica plana. (B) Primeira etapa de montagem da monocamada lipídica ocorre com acréscimo de mais solução em um dos compartimentos da câmara experimental. (C) Montagem da segunda monocamada lipídica. A deposição de cada uma das monocamadas lipídicas ocorre com a introdução de mais solução em cada um dos respectivos compartimentos da câmara. Na região central demonstra-se a mesa de amortecimento com a câmara experimental acoplada através de eletrodos à interface eletrônica de aquisição dos registros de corrente iônica. Esta interface é composta por amplificador e filtro passa-baixa conectados ao conversor analógico-digital acoplado a um microcomputador. Na parte inferior encontra-se um quadro da membrana lipídica com um único nanoporo inserido. A entrada e passagem da molécula de analitos (bolinha vermelha) através do nanoporo induzem bloqueios característicos na corrente iônica. A análise das amplitudes e durações dos bloqueios permite a identificação dos analitos; a análise da frequência dos bloqueios permite a quantificação dos analitos. A aquisição, armazenamento e análise das séries temporais (impressão digital) são processadas por um programa dedicado e a identificação do analito é realizada por comparação em um banco de dados de impressões digitais. Este banco de dados é montado com a calibração do sistema e registro de corrente iônica com analitos de alto grau de pureza
Figura 4
Influência da concentração e composição da solução na sensibilidade do nanoporo da alfatoxina. A) O valor da concentração do polietilenoglicol (PEG 2000) é menor (0,7 µmol L-1) na presença da solução iônica de elevada concentração de KCl (4 mol L-1), portanto, o aumento da concentração do KCl de 1 para 4 mol L-1, aumentou a sensibilidade do nanoporo em aproximadamente 214 vezes. Adaptado da Ref. 98. B) O valor da concentração do polietilenoglicol (PEG 1294) é menor (0,05 µmol L-1) na presença da solução iônica de fluoreto de potássio (4 mol L-1), portanto, a substituição do iodeto pelo fluoreto aumentou a sensibilidade do nanoporo em aproximadamente 130 vezes. As setas horizontais indicam o menor valor de concentração do analito (PEG), considerando a frequência dos bloqueios na corrente iônica, maior ou igual a 1 Hz como indicado pela linha vertical. Adaptado da Ref. 100
Figura 5
Capacidade do nanoporo da alfatoxina em detectar íons divalentes. (A) Representação esquemática do sítio de ligação introduzido por mutação no interior do nanoporo da alfatoxina. As setas indicam a interação de um íon (círculo cheio ou vazio) com o sítio de ligação. (B) Registros de bloqueios da corrente iônica, característicos de cada íon (Zn+2, Co+2, Cd+2). Cada registro resulta de um experimento em que apenas um dos íons foi adicionado à solução eletrolítica. (C) Registros da corrente iônica na presença de apenas íons de Co+2 na solução eletrolítica (primeiro traçado). Os três traçados inferiores representam sequencialmente os registros da corrente iônica à medida que se aumentou a concentração do Zn+2 para 35, 110 e 231 nmol L-1, respectivamente. As linhas cheias e tracejadas indicam o perfil de bloqueio na corrente, característico do Co+2 ou Zn+2, respectivamente. Adaptado da Ref. 25
Figura 6
Capacidade do nanoporo da alfatoxina na discriminação de moléculas enantioméricas. A β-ciclodextrina (βCD) foi acoplada na região mais estreita do nanoporo da alfatoxina mutante, diminuindo ainda mais seu diâmetro, portanto, reduz a corrente iônica que passa através do nanoporo como indicado pela linha contínua nos registros. a) Registro dos bloqueios na corrente iônica característica do (S)-ibuprofeno. A linha tracejada indica a amplitude dos bloqueios; b) Registro dos bloqueios na corrente iônica característica do (R)-ibuprofeno; c) Registro dos bloqueios da corrente iônica de ambas as formas enantioméricas do ibuprofeno. Ao lado direito de cada registro, os respectivos histogramas de amplitude dos bloqueios da corrente iônica. Nota-se claramente que o nanoporo é capaz de discriminar as formas enantioméricas do ibuprofeno. Adaptado da Ref. 27
Figura 7
Nanoporo da alfatoxina como espectrômetro de massas. Espectro de massa (superior) para o polietilenoglicol (PEG 1500, Mr=1500 g/mol) polidisperso obtido com o nanoporo unitário comparado ao espectro de massa (inferior) obtido pelo MALDI-TOF. Os histogramas representam o valor médio da corrente para cada amplitude de bloqueio referente a cada molécula do polímero. Os números na parte superior em cada “pico” do histograma indicam a quantidade de monômeros do etilenoglicol em cada molécula do polímero. Os maiores valores de I/Iopencorrespondem às moléculas de PEG de menor massa molecular. O I indica o valor de corrente iônica através do nanoporo quando este é ocupado pelo polietilenoglicol, e Iopen é o valor de corrente quando não há moléculas de PEG no interior do nanoporo da alfatoxina. O “pico” indicado pelo número 28 corresponde a análise da amostra de polietilenoglicol (PEG 1294) monodisperso. No MALDI-MS devido ao processo de desorção e ionização, cada molécula do PEG perde um O ou OH. Adaptado da Ref. 18
Figura 8
Nanoporo da alfatoxina como sequenciador de DNA. Representação esquemática do padrão de bloqueios na corrente iônica através do nanoporo da alfatoxina durante a translocação de ss-DNA. Observe que a amplitude dos bloqueios indicados pelas faixas coloridas é característica de cada base nucleotídica, representadas por: T=timina, A=adenina, C=citosina, G=guanina. Adaptado da Ref. 2
