Termoestabilidade de processos extrativos de Nasturtium officinale R. Br., brassicaceae por sistema Soxhlet modificado

Term-stability of extractive processes from Nasturtium officinale R. Br., brassicaceae for soxhlet modified system

thermo-stable; Soxhlet; Nasturtium officinale

NOTA TÉCNICA

Termoestabilidade de processos extrativos de Nasturtium officinale R. Br., brassicaceae por sistema Soxhlet modificado

Term-stability of extractive processes from Nasturtium officinale R. Br., brassicaceae for soxhlet modified system

João Luiz de Souza Carvalho; Miriam Machado Cunico; Josiane de Fátima Gaspari Dias^*; Marilis Dallarmi Miguel; Obdulio Gomes Miguel

Departamento de Farmácia, Universidade Federal do Paraná, Av. Prefeito Lothário Meissner, 3400, 80210-170 Curitiba - PR, Brasil

ABSTRACT

This work had as objective verified the term-stability of the Soxhlet modified system with analytical and pharmacothecnical application in extractive processes of Nasturtium officinale. It has proven that the process is thermo-stable. The analysis with analytical have determined 3.606 mg g^-1 in chlorogenic acid and 11.813 mg g^-1 in rutin (extract 1:20 w/v) and with pharmacotecnical 3.427 mg g^-1 in chlorogenic acid and 11.278 mg g^-1 in rutin (extract 1:6 w/v). The income of the pharmacothecnical process was inferior to the analytical, suggesting that the pharmacothecnical process would need of at least the double of time in each extraction system.

Keywords: thermo-stable, Soxhlet, Nasturtium officinale.

INTRODUÇÃO

Nasturtium officinale, conhecida popularmente como agrião, contém glucosinolatos (gluconasturtiin, precursor do feniletil isotiocianato e o 2-feniletilglucosinolato),^1,2 nitrilas (3-fenilpropionitrila e 8-metiltiooctanona nitrila), minerais (manganês, ferro, fósforo, iodo, cobre e cálcio), vitaminas A, C, E e nicotinamida.^1,3

Possui atividade antibacteriana, antiescorbútica, colagoga e propriedades expectorantes. Estudos farmacológicos demonstraram que esta espécie pode ser utilizada como protetora pulmonar de tabagistas contra agentes neoplásicos presentes no tabaco.¹ Apresenta potencial cardioprotetor,⁴ o que justifica seu uso popular para tal fim, e atividade hipolipidêmica, que pode ser atribuída ao seu potencial antioxidante.⁵

Dentre os diversos processos comumente utilizados para obtenção de extratos de N. officinale, tem-se alcoolatura (trituração com álcool 96%), maceração, percolação, turbólise (emprego de equipamento tipo liquidificador industrial, que pulveriza as partes vegetais e lava os conteúdos celulares) e o sistema Soxhlet, que permite a renovação do solvente sem adição de mais solvente. Estas possibilidades de extração resultam em produtos distintos quanto à qualidade e concentração de ativos, levando a resultados terapêuticos variáveis e diferentes custos finais.⁶

Dentro desta perspectiva, este trabalho teve como finalidade determinar a termoestabilidade do sistema Soxhlet, utilizando como referência dois compostos presentes no metabolismo secundário do N. officinale.^7-9 Paralelamente, verificou-se o rendimento de diferentes processos de obtenção de extratos.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A análise preliminar realizada por meio de cromatografia em camada delgada⁶ com utilização de padrões demonstrou a presença de fenólicos nos extratos analisados. A termoestabilidade do sistema Soxhlet foi previamente verificada e confirmada com as posteriores análises por meio de CLAE.

O método de CLAE utilizado para detecção simultânea dos compostos derivados do ácido clorogênico e rutina, para qualificação e quantificação nas amostras analisadas, foi validado conforme especificação da RE nº 899/03¹⁰ - categoria I. Os dados referentes à validação encontram-se na Tabela 1. Ao verificar a especificidade do método em dosar flavonóides em rutina e fenilpropanóides em ácido clorogênico encontram-se quantidades diferentes de resultados, pois a biblioteca da WorkStation D7000 do programa LaChrom na aquisição de dados (Reverse Library Search Results) encontrou seis estruturas relacionadas para rutina e quatro para ácido clorogênico.

As análises de CLAE realizadas nos extratos em estudo demonstraram composição rica em fenilpropanóides e flavonóides. Na Tabela 2 verificam-se os teores das substâncias analisadas nos diferentes processos extrativos. A colocação do "d-" antes de rutina ou ácido clorogênico indica que é um "derivado de", ou seja, apresenta mais de 95% de correlação com o pico padrão e o mesmo espectro segundo biblioteca eletrônica.

A alcoolatura teve a finalidade de servir como padrão para o processo extrativo inerte, assim como para comparação da composição de analitos em estudo no vegetal in natura antes da estabilização. O material vegetal fresco apresentou 6% de rendimento em sólidos a 45 ºC ou 94% de perda em água. A alcoolatura apresentou um teor de sólidos de 1,06% ou 7,42 g de sólidos nos 700 mL e 3,18 g de sólidos extraíveis nos 300 mL de alcoolatura impregnados no resíduo, perfazendo uma massa total de 10,6 g de extraíveis em 500 g (1000 mL de alcoolatura) de N. officinale in natura. Considerando-se 30 g de massa seca das 500 g de N. officinale in natura (6% de sólidos) obteve-se rendimento de 35,33% de sólidos da composição extraída (Tabela 3) e 0,673mg g^-1 de fenólicos calculados em ácido clorogênico e rutina (Tabela 2).

Na extração por dupla maceração, o extrato bruto de N. officinale apresentou 67% da solução extratora e os 33% restantes permaneceram no resíduo. A massa de sólidos extraída nas 500 g de planta foi de 110 g ou 22% de sólidos da composição extraída (Tabela 3) e 9,381 mg g^-1 de fenólicos calculados em ácido clorogênico e rutina (Tabela 2).

A extração em Soxhlet modificado com aplicação farmacotécnica obteve 1000 mL de extrato, com teor de 34,25% de sólidos da composição extraída (Tabela 3) e 14,705 mg g^-1 de fenólicos calculados em ácido clorogênico e rutina (Tabela 2).

Os extratos obtidos por dupla maceração e Soxhlet farmacotécnico tiveram a finalidade de simular o processo industrial. Os sistemas convencionais trabalham geralmente com maceração a frio desconsiderando os efeitos de solvatação, saturação do solvente com a constante de solubilização da composição química do vegetal a quente.

A extração em Soxhlet analítico modificado teve a finalidade de permitir o esgotamento total de extraíveis da droga para comparar a composição, fórmula percentual e o teor total dos analitos em estudo. Verificou-se um teor de 35,23% de sólidos da composição extraída (Tabela 3) e 15,419 mg g^-1 de fenólicos calculados em ácido clorogênico e rutina (Tabela 2).

Para verificação da termoestabilidade, preparou-se amostra padrão com ácido clorogênico e rutina em amido pelo processo Soxhlet modificado analítico e verificou-se por CLAE que 99,1% do ácido clorogênico e rutina adicionados no amido foram recuperados e não se detectou compostos da decomposição ou stress térmico do processo. Na extração do ácido clorogênico e rutina adicionados no material vegetal seco, obteve-se 99,3% de recuperação, sem apresentar compostos da decomposição no processo e inércia química com a composição do agrião pelo processo Soxhlet modificado analítico.

Todos os processos empregados no presente estudo apresentaram a mesma composição da alcoolatura utilizada como padrão e os processos Soxhlet reproduziram a mesma fórmula percentual de extraíveis, devido ao esgotamento total dos compostos.

Na Figura 1 verifica-se a especificidade do fingerprint entre as amostras e os padrões desta metodologia.

PARTE EXPERIMENTAL

Material vegetal

O material vegetal foi coletado em dezembro de 2005, identificado pelo Dr. G. Hatschbach e registrado no Museu Botânico de Curitiba sob o número 248503. Este material vegetal foi pré-estabilizado em condições ambientes e estabilizado em estufa ventilada a 45 ºC, por um período de 20 h. A padronização granulométrica foi realizada em um moinho de facas, com tamis de 8 mm.

Condições cromatográficas

Todos os reagentes e solventes foram adquiridos em grau P.A. ou HPLC (Merck^®). A água utilizada no preparo das soluções foi obtida por sistema de purificação e filtração Milli-Q (Millipore). Os padrões de ácido clorogênico e rutina utilizados foram adquiridos da Sigma^®.

A análise qualitativa preliminar foi realizada por meio de cromatografia em camada delgada, utilizando-se cromatoplacas de sílica gel F₂₅₀ (Merck^®), de dimensões 10 cm por 10 cm, onde 10 µL de cada amostra foi aplicada, intercalando com referências solubilizadas em metanol (1 mg mL^-1). As fases móveis e seus respectivos reveladores foram utilizados de acordo com a literatura.^6,11

As análises qualitativas e quantitativas foram realizadas por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), em aparelho Merck-Hitashi^® composto de bomba L7100, degaseificador de solventes L7812, válvula de injeção Rheodyne^® 7725i com loop de 20 µL, forno L-7300, detector DAD L7450, em 325 nm para ácido clorogênico e 350 nm para a rutina, interface L7000 conectada ao sistema operacional Windows^® NT e tratamento dos dados pela ChemiStation Lachrom^®. Utilizou-se a coluna analítica Phenomenex C₁₈ (4 x 250 mm, 5 µm).

A metodologia empregada para análise foi desenvolvida por Carvalho⁶ e validada de acordo com a resolução 899 de 29 de maio de 2003 da ANVISA (metodologia enquadrada na categoria I - validação de método analítico quantitativo para uma substância entre outros componentes)¹⁰ e foi otimizada para fenólicos,^6,12,13 num gradiente ternário, utilizando como fase móvel A 0,2% de ácido fosfórico em ácido sulfúrico 0,01 M, fase móvel B metanol e fase C acetonitrila. O gradiente de eluição foi: 0-3 min a 1,2 mL min^-1 de fluxo com 100% A; 3-5 min a 1,2 mL min^-1 de fluxo para 7% B e 3% C; 5-15 min a 1,2 mL min^-1 de fluxo para 16% B e 3% C; 15-40 min a 1,2 mL min^-1 de fluxo para 26% B e 15% C; 40-47 min a 1,3 mL min^-1 de fluxo para 26% B e 15% C; 47-48 min a 1,3 mL min^-1 de fluxo para 30% B e 30% C; 48-54 min a 1,3 mL min^-1 de fluxo para 30% B e 30% C; 55-60 min a 1,2 mL min^-1 de fluxo para 100% A.

A identificação dos compostos foi realizada pela ChemiStation Lachrom^® com base nos tempos de retenção das amostras e comparação com os tempos dos padrões, dados de literatura e de seus espectros introduzidos na biblioteca eletrônica (Reverse Library Search Results).^6,14-16

Para a construção da curva analítica da solução padrão^6,12,13 foram utilizados níveis de concentração em ácido clorogênico sendo 5, 10, 20,40, 45, 50 55 e 60 µg mL^-1 e rutina com 10, 20, 40, 80, 90, 100, 110 e 120 µg mL^-1 segundo norma.¹⁰

Os processos de extração foram comparados com dois grupos fenólicos, fenilpropanóides com ácido clorogênico (2) e flavonóides com rutina^14,17,18 (1). Para o preparo da solução padrão com ácido clorogênico e rutina, adicionou-se 20 mg de ácido clorogênico e 40 mg de rutina em um balão volumétrico de 100 mL e seu volume foi completado com etanol 85%.^6,9,10 Para análise por CLAE, as amostras de padrões foram diluídas com solução mista da fase móvel A:fase móvel B (1:1 v/v) e co-injetadas em todas as análises dos processos de extração.

Métodos de extração e análises

As extrações foram realizadas com solventes P.A. e em triplicata.

Alcoolatura e dupla maceração

Para a obtenção de alcoolatura foram triturados, por 2 min, 500 g da planta inteira fresca e 550 mL de etanol a 96%. Em seguida, esta solução foi submetida a uma maceração a frio, por 72 h e filtração a vácuo. A preparação da alcoolatura foi realizada de acordo com normas estabelecidas pela farmacopéia.^15,16 A alcoolatura foi concentrada, onde 250 mL foram concentrados para 40 mL e seu volume ajustado para 50 mL com etanol a 85%.

Para extração por dupla maceração, 500 g do material vegetal foram maceradas em 1000 mL de etanol 85% (850 mL de etanol 96% e 150 mL de água) em um percolador de 3 L. Após 72 h, procedeu-se à eluição que resultou na obtenção da primeira fração de 500 mL do extrato. O resíduo foi novamente extraído por maceração, durante 72 h, após adição de 500 mL de etanol 85%, produzindo a segunda fração de 500 mL do extrato. Pela reunião destas duas frações foram obtidos 1000 mL de extrato bruto etanólico.

O teor de sólidos da alcoolatura e da dupla maceração foi determinado por meio de perda por estufa a 45 ºC, por 3 h, utilizando-se uma alíquota de 10 mL de amostra, em triplicata. Para análise de fenólicos por CLAE, 500 µL de alcoolatura e 300 µL da dupla maceração foram diluídos em 500 e 900 µL, respectivamente, em solução mista de fase móvel A e fase móvel B (1:1 v/v) em tubo Eppendorf de 1,5 mL.

Soxhlet modificado farmacotécnico

No Soxhlet modificado com aplicação farmacotécnica, há substituição do sistema de percolação por uma placa de teflon perfurada (Figura 3) e recoberta com algodão, com o objetivo de filtrar a solução extratora eluída.

Foram adicionados 500 g de material vegetal no extrator, 1500 mL de etanol 85% sobre o material vegetal para umectação (por 30 min) e 1500 mL de etanol a 85% (1275 mL de etanol 96% e 225 mL de água) no balão de fundo chato (para conexão com o sistema Soxhlet, utiliza-se balão com junta 24/40 ou 29/42). O processo de extração foi mantido por 5 h (para conexão com o condensador, utiliza-se junta 71/60). Em seguida, concentrou-se o extrato do balão para aproximadamente 800 mL. O extrato foi transferido para um balão volumétrico e completado o volume com etanol (85%) para 1000 mL.

O teor de sólidos dos extratos foi determinado por meio de perda por estufa a 45 ºC por 3 h, utilizando alíquota de 10 mL de amostra, em triplicata.

Para análise de fenólicos por CLAE, 150 µL de amostra foram diluídas em 1350 µL de solução mista de fase móvel A e fase móvel B (1:1 v/v) em tubo Eppendorf de 1,5 mL.

Soxhlet analítico modificado

A preparação do extrato analítico foi feita adicionando-se 10 g do material vegetal num cartucho de vidro tipo Pyrex^® com base de vidro sinterizado G3 (Figura 4), 50 mL de etanol 85% (85 mL de etanol 96% e 15 mL de água) deixando o sistema em repouso por 30 min, para umectação da droga. Em seguida, 150 mL de etanol 85% foram adicionados ao balão de fundo chato (para conexão com o sistema Soxhlet, utiliza-se balão com junta 24/40) e conectou-se ao extrator. Esse procedimento ficou ativo por 4 h (para conexão com o condensador, utiliza-se junta 45/50). O extrato obtido foi concentrado para 80 mL e seu volume completado para 100 mL com etanol 85%.

O teor de sólidos dos extratos foi determinado por meio de perda por estufa a 45 ºC por 3 h, utilizando alíquotas de 10 mL de amostra, em triplicata.

Para o preparo da amostra padrão, os padrões, ácido clorogênico e rutina foram extraídos em Soxhlet modificado com aplicação de 20 mg de ácido clorogênico e 40 mg de rutina num cartucho de vidro tipo Pyrex^® com base de vidro sinterizado G3, contendo 10 g de amido. Foram adicionados 50 mL de etanol (85%) deixando o sistema em repouso por 30 min, para umectação do material vegetal. Em seguida, 150 mL de etanol 85% foram adicionados ao balão de fundo chato e conectou-se ao extrator. Esse procedimento ficou ativo por 4 h. O extrato obtido foi concentrado para 80 mL e seu volume completado para 100 mL com etanol (85%).

Para verificação da inércia e termoestabilidade, 10 g de material vegetal, 20 mg de ácido clorogênico e 40 mg de rutina foram utilizados em processo idêntico ao de preparação do extrato analítico e amostra padrão. Para análise de fenólicos por CLAE, 300 µL de amostra padrão, 500 µL do extrato analítico e 300 µL de extrato, para verificação da inércia e termoestabilidade, foram diluídos em 900, 500 e 900 µL, respectivamente, em solução mista de fase móvel A e fase móvel B (1:1 v/v) da CLAE, em tubo Eppendorf de 1,5 mL.

CONCLUSÕES

Neste trabalho verificou-se a termoestabilidade no sistema Soxhlet modificado, ou seja, no processo extrativo não ocorreu variação da composição do mesmo, com o efeito da temperatura. A termoestabilidade foi avaliada por CLAE e o teor de fenólicos, calculado em ácido clorogênico e rutina, comprovou que o processo é termoestável ao efeito da temperatura e que atende às normas da ANVISA. Este processo mostrou-se limpo, rápido, reprodutível e com alto rendimento em extraíveis em relação ao teor de sólidos, apresentando no extrator o resíduo do material vegetal incorporado com o etanol destilado do final do processo.

No processo analítico obteve-se 35,23% de sólidos a partir de 10 g de planta para 200 mL de solvente extrator (1:20) e no farmacotécnico, 34,25% de sólidos a partir de 500 g para 3000 mL de solvente extrator (1:6). Isto sugere que o processo farmacotécnico necessitaria de pelo menos o dobro de tempo em cada sistema de extração para se equiparar ao analítico, tornando-se inviável em custo de energia e tempo disponível do equipamento e na utilização industrial, devido ao custo final do produto.

AGRADECIMENTOS

Aos colaboradores H. Dias Jr. e F. S. F. Smolarek, ao Departamento de Farmácia da Universidade Federal do Paraná e ao CNPq.

Recebido em 6/12/07; aceito em 26/9/08; publicado na web em 2/2/09

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  09 Jun 2009
• Data do Fascículo
  2009

Histórico

• Aceito
  26 Set 2008
• Recebido
  06 Dez 2007