Enzima inativadora de bradicinina liberada de fígado preservado ex-vivo

Bradykinin-inactivating enzyme is released from the ex-vivo stored liver

Resumos

OBJETIVO: - O fígado inativa quantidades consideráveis de bradicinina; a principal enzima hepática cinino-inativadora (BIE, bradykinin inativating endopeptidase) hidrolisa especificamente a ligação Phe5-Ser6 do nonapeptídio e foi caracterizada como sendo a oligoendopeptidase EC 3.4. 24.15. No transplante ortotópico de fígado existe correlação entre aumento da concentração de aminoácidos no líquido de preservação (conseqüência de proteólise) e falência do enxerto. O objetivo deste trabalho é verificar se ocorre liberação da BIE de fígados preservados ex-vivo no líquido Braun-Collins ou em solução de Krebs-Henseleit bicarbonato (Krebs). MÉTODO: Fígados de ratos Wistar (180-220g) foram exsangüinados e após remoção foram preservados em líquido Braun Collins ou em solução Krebs, a 4oC. Foram retiradas alíquotas do líquido de preservação nos tempos 0, 4, 8 e 24 horas, para dosagem de ALT, AST, DHL e BIE. A atividade fluorimétrica da BIE foi ensaiada com o substrato Abz-RPPGFSPFRQ-EDDnp (análogo sintético da bradicinina) e sua presença confirmada por immunoblotting, revelado com anticorpo específico anti-EC 3.4.24.15. RESULTADOS: A liberação de ALT, AST, DHL e BIE é significativa no período 8-24hs. Nas alíquotas de 24 hs, em relação ao tempo zero, a concentração das quatro enzimas aumentou, respectivamente, no líquido Braun Collins, 8, 7, 19 e 10 vezes e, na solução de Krebs, 21, 17, 27 e 21 vezes; a relação ALT/DHL foi sempre inferior a um. CONCLUSÃO: Ocorre liberação de BIE durante a preservação ex-vivo do fígado, o que poderá servir como indicação da condição de preservação do enxerto; diminuição da capacidade cinino-inativadora do fígado poderá afetar sua reatividade vascular.

Bradicinina; Endopeptidase; Fígado; Cininase; Transplante hepático

Artigo Original

Enzima inativadora de bradicinina liberada de fígado preservado ex-vivo

F.V. Morais, H.M. Molina, D.R. Borges, M. Kouyoumdjian

Laboratório de Hepatologia Experimental ¾ Departamentos de Bioquímica e Medicina da Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina, São Paulo, SP.

RESUMO

OBJETIVO - O fígado inativa quantidades consideráveis de bradicinina; a principal enzima hepática cinino-inativadora (BIE, bradykinin inativating endopeptidase) hidrolisa especificamente a ligação Phe⁵-Ser⁶ do nonapeptídio e foi caracterizada como sendo a oligoendopeptidase EC 3.4. 24.15. No transplante ortotópico de fígado existe correlação entre aumento da concentração de aminoácidos no líquido de preservação (conseqüência de proteólise) e falência do enxerto. O objetivo deste trabalho é verificar se ocorre liberação da BIE de fígados preservados ex-vivo no líquido Braun-Collins ou em solução de Krebs-Henseleit bicarbonato (Krebs).

MÉTODO. Fígados de ratos Wistar (180-220g) foram exsangüinados e após remoção foram preservados em líquido Braun Collins ou em solução Krebs, a 4ºC. Foram retiradas alíquotas do líquido de preservação nos tempos 0, 4, 8 e 24 horas, para dosagem de ALT, AST, DHL e BIE. A atividade fluorimétrica da BIE foi ensaiada com o substrato Abz-RPPGFSPFRQ-EDDnp (análogo sintético da bradicinina) e sua presença confirmada por immunoblotting, revelado com anticorpo específico anti-EC 3.4.24.15.

RESULTADOS. A liberação de ALT, AST, DHL e BIE é significativa no período 8-24hs. Nas alíquotas de 24 hs, em relação ao tempo zero, a concentração das quatro enzimas aumentou, respectivamente, no líquido Braun Collins, 8, 7, 19 e 10 vezes e, na solução de Krebs, 21, 17, 27 e 21 vezes; a relação ALT/DHL foi sempre inferior a um.

CONCLUSÃO. Ocorre liberação de BIE durante a preservação ex-vivo do fígado, o que poderá servir como indicação da condição de preservação do enxerto; diminuição da capacidade cinino-inativadora do fígado poderá afetar sua reatividade vascular.

UNITERMOS: Bradicinina. Endopeptidase. Fígado. Cininase. Transplante hepático.

INTRODUÇÃO

O sistema calicreína-cinina é composto de procalicreínas, calicreínas (tecidual e plasmática), cininogênios, cininas, cininases e enzimas conversoras de cininas. Procalicreínas dão origem às calicreínas que, agindo sobre cininogênios, liberam cininas; aminopeptidases convertem precursores de bradicinina em bradicinina; cininases degradam tanto a bradicinina quanto seus precursores. A bradicinina¹ é nonapeptídio que exerce suas ações, em concentração nanomolar, após interagir com receptores específicos da membrana plasmática de células-alvo. Sua meia-vida no plasma é inferior a um minuto², sendo rapidamente inativada por cininases teciduais. A inativação fisiológica da bradicinina (BK) foi, durante algum tempo, atribuída quase exclusivamente à ação da cininase II (enzima conversora de angiotensina, ACE) encontrada no endotélio vascular, principalmente na circulação pulmonar. Entretanto, o fígado também apresenta importante atividade cininásica^3,4. Recentemente, demonstramos⁵ a semelhança entre a endopeptidase hepática inativadora de bradicinina (principal cininase hepática) e a metalo-endopeptidas etiol-dependente EC 3.4.24.15.

As ações biológicas e efeitos farmacológicos das cininas são mediados por dois tipos diferentes de receptor, denominados B₁ e B₂⁶. Entre as principais ações fisiológicas da bradicinina está sua participação nos mecanismos de controle do tônus vascular. A ação vasodilatadora arterial da bradicinina deve-se principalmente à ativação de receptores B₂ na superfície de células endoteliais, seguida pela liberação de óxido nítrico (NO) e prostaciclina. Bradicinina promove mudança bifásica do pH intracelular, que pode também modular a liberação de NO pela célula⁷. No sistema venoso portal, a bradicinina tem ação hipertensora⁴.

Apesar das cininas participarem da regulação de sistemas fisiológicos, são mais conhecidas suas ações na doença: choque, asma, dor e muitas formas de inflamação envolvem a mediação desses peptídios. Cininas podem evocar os sinais cardinais da inflamação (dor, edema, rubor e calor) e estão próximas do topo da cascata de mediadores envolvidos no processo inflamatório. Na doença, a BK é produzida quando lesão vascular expõe polissacarídeos sulfatados carregados negativamente, ativando o sistema de contato da coagulação. A BK é liberada também quando há oxigenação tecidual inadequada em decorrência de perfusão tecidual deficiente. Na lesão tecidual ou infecção, acúmulo, aderência e ativação de neutrófilos, soma outros mediadores ao local de inflamação, potencializando a ação das cininas. Em muitos tecidos, BK estimula a fosfolipase A₂, promovendo a liberação de ácido aracdônico; prostaglandinas e leucotrienos produzidos a partir do ácido aracdônico são especialmente importantes na dor e inflamação. Em infecções, várias enzimas bacterianas podem liberar BK diretamente de seu precursor. Esses mecanismos apontam os antagonistas da BK como medicamentos antiinflamatórios potencialmente poderosos e úteis⁸.

O fígado tem papel fundamental na modulação das ações do sistema calicreína-cinina; se por um lado sintetiza proteínas deste sistema, por outro é o responsável pela captação e catabolismo de produtos da cascata proteolítica. Podemos resumir a participação do fígado na modulação do sistema calicreína-cinina da seguinte forma: sintetiza cininogênios⁹ e procalicreína plasmática¹⁰, converte precursores de bradicinina em bradicinina¹¹, inativa bradicinina^12,13 e depura as calicreínas teciduais¹⁴ e plasmática, esta livre¹⁵ ou complexada com inibidor¹⁶. Na fase aguda da inflamação, ocorre aumento da produção de procalicreína pelo fígado¹⁷ e também aumento da capacidade hepática de depurar calicreína plasmática¹⁸. Assim, modulando o sistema calicreína-cinina, o fígado participa do controle do processo inflamatório e do tônus vascular.

O transplante ortotópico de fígado é terapia estabelecida para pacientes com doença hepática, porém vários problemas do procedimento ainda precisam ser resolvidos. Foi observada correlação entre aumento da concentração, no líquido de preservação ex vivo do órgão a ser transplantado, de algumas enzimas (metalo e aspartatoproteases) e aminoácidos (isoleucina, cisteína, metionina, treonina e, principalmente, valina) com a falência do enxerto, o que sugere que atividade proteolítica deste esteja relacionada com disfunção do enxerto no pós-operatório imediato¹⁹.

Sendo a oligoendopeptidase BIE (bradykinin inativating endopeptidase) a principal enzima cinino-inativadora do fígado, o objetivo deste trabalho foi comparar sua liberação, com a de outras enzimas, de fígados exsangüinados e preservados por até 24 horas.

MATERIAL

Ratos adultos da raça Wistar, criados e fornecidos pelo Biotério Central da Universidade Federal de São Paulo (Escola Paulista de Medicina), foram manipulados de acordo com o International Guiding Principles for Biomedical Research Involving Animals²⁰. Líquido de "Braun Collins G 3,57 s/Mg" contendo glicose 3,57% em solução hiperosmolar de eletrólitos foi gentilmente cedido pelo Dr. José Osmar de Abreu Pestana, Disciplina de Nefrologia, UNIFESP. A solução Krebs-Henseleit-bicarbonato pH 7,4-7,6 (Krebs) foi preparada com a seguinte composição: NaCl 115mM, KCl 5,9mM, MgCl₂.6H₂O 1,2mM, NaHCO₃ 25mM, NaH₂PO₄.H₂O 1,2mM, Na₂SO₄ 1,2mM e CaCl₂.2H₂O 2,5mM.

A enzima EC 3.4.24.15 e o anticorpo anti-EC 3.4.24.15 foram gentilmente cedidos por MJ Glucksman, Mount Sinai School of Medicine, NY, EUA; o segundo anticorpo anti-IgG de coelho, gerado em carneiro e conjugado com peroxidase, foi obtido da Sigma Chemical (EUA).

Para a determinação da atividade fluorimétrica da BIE, foi utilizado o substrato Abz-RPPGFSP FRQ-EDDnp (análogo sintético da bradicinina); para determinação de atividade amidolítica foi usado o substrato Acetil-Phe-Arg-paranitroanilida (Acetil-Phe-Arg-pNA). Ambos substratos foram sintetizados e fornecidos por L. Juliano Neto, Departamento de Biofísica, UNIFESP.

MÉTODO

A exsangüinação de fígados foi realizada a 37°C, como descrito anteriormente¹⁵: em rato anestesiado (injeção intraperitoneal de solução aquosa de uretana 200g/L na dose de 1,3mg/g peso) e mantido com respiração artificial, as cavidades abdominal e torácica eram abertas e as veias porta e cava inferior, acima do diafragma, canuladas. A exsangüinação era obtida com 200mL de solução salina (NaCl 0,15M) em circuito aberto, com fluxo constante de 28 mL/minuto. A pressão de perfusão foi continuamente monitorada por manômetro de água colocado no circuito antes da cânula portal e variou de 10 a 16cm de H₂O. Após a exsangüinação, o fígado era retirado, armazenado em 50mL de solução Krebs ou em líquido Braun Collins e mantido a 4ºC. Amostras do líquido de preservação do fígado foram obtidas nos tempos 0, 4, 8 e 24 horas e usadas para dosagens enzimáticas. O líquido de 24 hs, de alguns experimentos, foi concentrado e dialisado sob pressão para caracterização da BIE.

A atividade fluorimétrica da BIE foi medida pela hidrólise de substrato fluorescente Abz-RPPGFSPFRQ-EDDnp incubando-se alíquotas de 50mL a 37ºC com 10mL de substrato (1mg/mL) em volume final de 1mL de Tris-HCl 50mM contendo b mercaptoetanol 2,5mM, pH 8,0. A reação era interrompida em banho de gelo e a fluorescência do substrato hidrolisado medida em fluorímetro Hitachi F-2000 (l_EM = 420nm e l_EX = 320nm). Atividade amidolítica para detecção de serinoprotease tripsina-símile foi medida incubando-se alíquotas de 50mL a 37ºC com acetil-Phe-Arg-pNa (concentração final 0,5mM em tampão Tris-HCl 50mM, pH 8,0 contendo NaCl 12mM,); a reação era interrompida com 0,8mL de ácido acético 15% e a absorbância da para-nitroanilina formada medida em 405nm.

O líquido no qual o fígado foi preservado por 24 hs foi concentrado em sistema de diálise sob pressão (1,2-1,4kg/cm² de nitrogênio) a 4ºC. A membrana de diálise era introduzida no interior de tubo de vidro contendo o tampão desejado; o tampão era trocado e a pressão checada a cada 10-14 hs, até que o material fosse reduzido ao volume desejado.

Alíquotas assim concentradas foram submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS e immunoblotting. No immunoblotting, a transferência de proteína do gel de poliacrilamida para a nitrocelulose foi realizada usando-se o método semi-seco. Feito o sanduíche, era aplicada corrente de 0,8mA/cm² de gel por 90min. Após a transferência das proteínas para nitrocelulose, foram realizadas as etapas de lavagem da membrana, bloqueio, incubação com o primeiro anticorpo overnight 4ºC, incubação com o segundo anticorpo por 15minutos com solução 3,3'-diaminobenzidina (DAB) sem H₂O₂ (escuro); incubação com DAB contendo H₂O₂ até o aparecimento das bandas; interrupção da reação pela remoção da solução que contém H₂O₂ e lavagem do blot com tampão.

Proteínas foram dosadas pelo método de Coomassie Blue e ALT, AST, DHL por métodos rotineiros a 37º C, segundo a IFCC.

RESULTADOS

Foram perfundidos dez fígados de rato, dos quais cinco foram preservados a 4ºC em líquido de Braun Collins e os outros cinco em solução de Krebs. Houve aumento na liberação de todas as enzimas dosadas, principalmente no período de 8-24 hs (figura 1). O aumento na alíquota de 24 hs em relação à alíquota zero de fígados preservados em líquido Braun Collins para ALT, AST, DHL e BIE foi, respectivamente, de 8, 7, 19 e 10 vezes, e quando o fígado foi preservado em solução Krebs, de 21, 17, 27 e 21 vezes. A diferença observada com os dois líquidos de preservação não foi estatisticamente significante (p>0,05). Durante todo o período de observação, a relação ALT/DHL foi sempre inferior a 1. Alíquotas incubadas por 2 hs a 37ºC com acetil-Phe-Arg-pNa não liberaram p-nitroanilina, o que sugere não haver liberação de serinoprotease tripsina-símile para o líquido de preservação.

As amostras obtidas após 24 hs de preservação em Braun Collins e Krebs e concentradas continham 0,24 e 0,22mg de proteína/mL, respectivamente. A figura 2 mostra o immunoblotting incubado com anticorpo específico para EC 3.4.24.15, que identificou a BIE no líquido de preservação (24hs).

DISCUSSÃO

No transplante hepático, a disfunção do enxerto no pós-operatório imediato pode ser resultado de fatores tanto do doador como do receptador, mas aceita-se que na maioria dos casos é decorrente da preservação do órgão. A lesão do fígado transplantado é caracterizada pelos seguintes três componentes: isquemia a frio durante armazenamento e transporte do órgão, isquemia morna durante o ato operatório e lesão de reperfusão²¹. Os esforços para minimizar a lesão durante a preservação focalizaram-se na composição do líquido usado para banhar o órgão durante o período de isquemia a frio, no sentido de evitar inchaço celular, acidose, edema intersticial e de fornecer antioxidantes e substratos que evitem a depleção de ATP²². Recentemente, foi proposto que outro fator deve ser considerado: inibição da proteólise¹⁹.

A endopeptidase cinino-inativadora é enzima proteolítica que hidrolisa a ligação Phe⁵-Ser⁶ da bradicinina; difere da ACE (pois não converte angiotensina I em angiotensina II), não hidrolisa angiotensina I nem angiotensina II e não tem atividade aminopeptidásica^12,13. Esta enzima proteolítica não é removida do fígado isolado e exsangüinado de rato quando perfundido durante curto período de tempo com solução salina¹². Entretanto, a adição de detergente (Triton X-100, 0,05%) ao líquido de perfusão faz com que quantidade expressiva da BIE seja removida do órgão¹². Comprovamos agora que a enzima liberada do fígado preservado ex vivo, após algumas horas, é a thimet peptidase, ou seja, a metalopeptidase tiol-dependente⁵: hidrolisa substrato sintético análogo à bradicinina e é reconhecida por anticorpo específico (anticorpo anti-EC 3.4.24.15). Esta liberação é até certo ponto específica, pois serinoproteases tripsina-símiles não foram liberadas nas condições experimentais utilizadas.

Estudos feitos em relação a enzimas liberadas durante a estocagem do fígado mostraram que aumento de aspartato e metaloproteases no líquido de preservação está relacionado com a falência do enxerto. Neste trabalho, dosamos algumas destas enzimas; constatamos que o líquido Braun Collins foi mais eficiente na preservação do órgão em relação à solução Krebs, pois a liberação das enzimas foi aritmeticamente menor, embora sem significância estatística (p > 0,05).

A BIE pode ser uma das enzimas responsáveis pela proteólise que ocorre no fígado durante sua preservação ex vivo, podendo ser, também, usada como marcador dessa proteólise, auxiliando no estudo de melhores condições de preservação do enxerto e no prognóstico de sucesso do transplante.

A relação ALT/DHL encontrada no líquido de preservação foi inferior a um durante todo o tempo de observação, o que é característico de lesão isquêmica, em contraposição à lesão da hepatite viral, quando esta relação é tipicamente superior a quatro²³.

Caso a perda de BIE durante a preservação ex vivo do fígado signifique perda de capacidade cinino-inativadora do enxerto, pode-se especular que isto possa modificar a modulação da reatividade vascular no órgão transplantado.

SUMMARY

Bradykinin-inactivating enzyme is released from the ex-vivo stored liver

BACKGROUND. The liver inactivates considerable amounts of bradykinin; the main liver kinin-inactivating enzyme (BIE, bradykinin inactivating endopeptidase) hydrolyses specifically the Phe⁵-Ser⁶ bond of the nonapeptide and it has been characterized as the oligoendopeptidase E.C. 3.4.24.15. When orthotopic liver transplantation is performed there is a correlation between the increase of amino acid concentration in the preservation fluid (as a consequence of proteolysis) and graft dysfunction.

AIM. Verify if BIE is released from livers stored ex vivo.

METHOD. Wistar rats (180-220g) livers were exsanguinated and after removal were preserved in Braun Collins fluid or Krebs solution at 4^o C. Aliquots were collected from the preservation fluid at 0, 4,8,24h, for ALT, AST, LDH and BIE assays. The fluorimetric activity of BIE was assayed upon Abz-RPPGFSPFRQ-EDDnp (synthetic BK analogue) and its presence was confirmed by immunoblotting, revealed with specific antibody anti-E.C.3.4.24.15.

RESULTS. The release of ALT, AST, LDH and BIE is significant between 8-24h. In the 24h aliquots the four enzymes concentration increased in the Braun Collins fluid 8,7,19 and 10 respectively, and in the Krebs solution 21, 17, 27, 21 respectively, when compared to the zero time aliquot activities. The ratio ALT/LDH was always < 1.

CONCLUSION. There is BIE release during ex vivo liver storage; this information may be useful as an indicator of the graft preservation condition; a decrease of the liver kinin-inactivating capability could affect the graft vascular reactivity. [Rev Ass Med Brasil 1999; 45(1): 19-23.]

KEY WORDS: Bradykinin. Endopeptidase. Cininase. Liver transplantation.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  21 Jun 2000
• Data do Fascículo
  Mar 1999