Teor de flavonóides e fenóis totais em folhas de Pyrostegia venusta Miers. de mata e de cerrado

Teor de flavonóides e fenóis totais em folhas de Pyrostegia venusta Miers. de mata e de cerrado¹

MÁRCIA DÉBORA DOS SANTOS² e CECÍLIA TERUMI TERADAIRA BLATT³

(recebido em 27/06/97; aceito em 9/12/97)

ABSTRACT - (A quantitative analysis of foliar flavonoids and total phenolics of Pyrostegia venusta Miers. from both the forest and cerrado). A quantitative analysis of the foliar flavonoids, total phenolics, and tannins of Pyrostegia venusta originating from the forest and cerrado were carried out to check the influence of these biocores in the production of these elements. The results for both flavonoids and phenolics revealed no significant differences between forest and cerrado, plants, this thus implying that the species does not present phenotipic plasticity based upon these characters, when considering soil differences of both places. Tannins were absent in the leaves of this plant.

RESUMO - (Teor de flavonóides e fenóis totais em folhas de Pyrostegia venusta Miers. de mata e de cerrado). Foram realizadas análises quantitativas de flavonóides, fenóis solúveis e taninos de folhas de Pyrostegia venusta coletadas na mata e no cerrado, com o objetivo de verificar a influência desses biócoros na sua produção. Tanto os resultados de flavonóides como os de fenóis não mostraram diferenças significativas entre as plantas de mata e cerrado, sugerindo que a espécie não apresenta plasticidade fenotípica baseada nesses caracteres, considerando as diferenças de solo dos locais de coleta. Não foram detectados taninos nas folhas desta espécie.

Key words - Flavonoids, total phenolics, tannins, Pyrostegia venusta

Introdução

Os vegetais superiores sintetizam e acumulam uma grande diversidade de compostos fenólicos, cujo papel no metabolismo da planta não está inteiramente elucidado (Julkunen-Tiitto 1985). Este grupo de compostos secundários se destaca por ser regularmente avaliado em muitos estudos de interação planta/herbívoro (Ossipov et al. 1995). Tais compostos parecem também estar envolvidos em, praticamente, qualquer interação da planta com o ambiente abiótico. Fatores abióticos naturais como irradiação solar, luz UV, seca, nutrientes e estações do ano influenciam no metabolismo e na produção destes compostos (Mole & Waterman 1988, Gartlan et al. 1980, Glyphis & Puttick 1988). Além disso, tem-se demonstrado que fatores artificiais, como poluentes, podem interferir também nesse mecanismo (Jordan et al. 1991).

Os fenóis vegetais são numerosos e variados, estando representados em quase todas as classes de metabólitos secundários (Smith 1976). Na classificação de Waterman & Mole (1994) são descritos fenóis simples (com um único anel aromático), metabólitos mais complexos baseados no esqueleto C

6C3, metabólitos com o esqueleto carbônico C6C0-2C6, metabólitos com o esqueleto C6C3C6, quinonas, benzofenonas e substâncias afins, alcalóides, terpenos e, finalmente, fenóis mascarados. Os taninos, como classe individual, têm sido os compostos fenólicos mais estudados em ecologia química, depois de fenóis totais, os quais têm merecido maior atenção. O termo tanino tem um uso extensivo e longamente estabelecido, mas a definição exata desses constituintes vegetais não é simples. Segundo Waterman & Mole (1994), provavelmente, a definição mais aceitável é a de Bate-Smith & Swain (1962), na qual classificam os taninos vegetais como "compostos fenólicos solúveis em água, tendo peso molecular entre 500 e 3.000 e que, ao lado de reações fenólicas usuais, têm a propriedade de precipitar alcalóides, gelatinas e outras proteínas". De uma forma mais simples, pode-se dizer que taninos são substâncias com sabor adstringente e que têm capacidade de curtir o couro (Vickery & Vickery 1981). Segundo Haslam (1988), "polifenóis vegetais" seria a forma mais correta para esta classe de compostos secundários; porém, nem todos os polifenóis são taninos (Waterman & Mole 1994). Os flavonóides também são compostos fenólicos e têm sua estrutura baseada em 2-fenil-benzopirano (C6C3C6), sendo representados por várias classes, de acordo com o grau de oxidação do anel central (Harborne 1973). Nas folhas, as flavonas e os flavonóis, por apresentarem sistemas mais conjugados, são considerados os principais pigmentos que absorvem luz UV (Harborne 1977), além de serem os mais comuns (Pietta et al. 1989).

Pyrostegia venusta Miers. (Bignoniaceae), conhecida popularmente por flor-de-são-joão, é uma trepadeira lenhosa, de ampla distribuição no Brasil, do sul ao nordeste, com exceção do norte (Lorenzi 1991). A espécie tem recebido pouca atenção por parte de fitoquímicos, com registro de pirostegina, um glicosídeo provavelmente relacionado com a toxidez da planta (Lorenzi 1991), carotenóides nas flores (Harborne 1967) e rutina nas folhas (Blatt et al. 1998).

Ao considerar o pressuposto que o solo de cerrado e de mata apresentam diferenças na sua fertilidade e que este fator pode levar a diferenças na produção de compostos fenólicos, este trabalho teve como objetivo verificar se indivíduos de P. venusta, ocorrentes na mata e no cerrado, apresentavam diferenças nos teores de fenóis totais, flavonóides e taninos.

Material e métodos

Folhas de P. venusta foram coletadas nas margens do cerrado da Fazenda Campininha (Moji Guaçu, SP), em outubro/95 e nas margens das matas do Parque Estadual das Fontes do Ipiranga, São Paulo, SP, em outubro/95. A amostragem constituiu-se de 10 indivíduos de cada ambiente, resultando em duas amostras com 10 repetições cada, para as análises de flavonóides totais, fenóis totais e taninos.

A dosagem de flavonóides foi feita de acordo com Rio (1996) modificado, onde se utilizou rutina como padrão, em solução de cloreto de alumínio. Dois gramas de folhas secas e pulverizadas foram extraídos com 150 ml de metanol (MeOH) 70% em Soxhlet por três horas; o extrato foi filtrado e o volume completado para 250 ml. Uma alíquota de 15 ml foi colocada em balão volumétrico acrescida de 1 ml de solução de cloreto de alumínio (5 g de cloreto de alumínio em 100 ml de MeOH, segundo Markham 1982), sendo o volume completado para 50 ml. Após repouso de 30 minutos, fez-se leitura a 425 nm em espectrofotômetro UV/visível Beckman DU 70 para se obter a concentração de flavonóides (mg/ml). A análise foi feita em triplicata. Os dados de absorbância das amostras foram comparados com uma curva padrão construída a partir de soluções com concentrações crescentes de rutina. A solução padrão de rutina foi preparada com MeOH 70% numa concentração de 100 mg/ml. Alíquotas de 3,5 (7,5 mg/ml) a 7,5 ml (15mg/ml), com intervalos de 0,5 ml foram utilizadas para a confecção da curva-padrão, acrescidas de l ml de cloreto de alumínio e completadas para 50 ml com MeOH 70%.

Para a análise de fenóis totais, 500 mg de folhas secas em estufa (±60ºC) e pulverizadas foram extraídos com 5 ml de MeOH 50% por cinco vezes em balão de 50 ml sob refluxo até o início da fervura. O volume foi completado para 25 ml. A extração de cada indivíduo foi realizada em triplicata. Os fenóis solúveis foram quantificados segundo o método de Folin-Dennis (Swain & Hillis 1959). Aplicou-se o teste t aos resultados, a fim de se verificar se há diferença significativa entre os dados obtidos para plantas de mata e de cerrado.

Os mesmos extratos preparados para a análise dos fenóis totais foram utilizados para a quantificação de taninos segundo o método de difusão radial (Hagerman 1987). Fez-se análise de uma amostra de terra dos dois locais onde foram coletados os indivíduos de P. venusta. A análise foi realizada pelo Laboratório de Análises de Solo, Departamento de Ciência do Solo, ESALQ, utilizando-se a metodologia da Fundação Cargill-IAC, com resina trocadora de íons (Van Raij et al. 1987).

Resultados e DiscussãoMuito se fala em variação química de plantas da mesma espécie em relação a diferenças abióticas, tais como condições edáficas, clima, radiação solar, nutrição mineral, etc., mas, na prática, pouco se conhece sobre esse tema.

Hipóteses surgiram na década de 70 como, por exemplo, a de Janzen (1974), que predizia que altas concentrações de compostos secundários ocorreriam em vegetação tropical crescendo em solos pobres em nutrientes. Esta hipótese foi apoiada por um trabalho realizado na África, onde se verificou uma diferença significativa no conteúdo de fenóis em folhas de árvores crescendo em solo arenoso infértil comparado ao de solos mais férteis (Gartlan et al. 1980). Nascimento & Langenheim (1986) não observaram diferenças significativas na composição de sesquiterpenos e fenóis em folhas de Copaifera multijuga (Leguminosae) provenientes de solos com contrastes físicos e químicos da Floresta Amazônica Central. Segundo os autores, as relações entre os nutrientes do solo e a produção de metabólitos secundários parecem ser muito mais complexas do que a hipótese sugerida por Janzen (1974).

P. venusta também não apresentou diferenças significativas nos conteúdos de fenóis e flavonóides totais em folhas de indivíduos da mata e do cerrado (tabela 1), baseadas em diferenças edáficas. Para a avaliação da fertilidade dos solos de mata e cerrado foram levadas em consideração as determinações de pH, MO, P, K, Ca, Mg e Al nocivo. Na tabela 2 verifica-se que o solo da mata apresentou uma concentração de alumínio maior que a do cerrado (17,0 e 9,0 mmolc.dm

-3, respectivamente). O solo do cerrado é considerado rico em alumínio (Goodland 1971); porém, solos de floresta podem ter teores de alumínio equivalentes ou até maiores em comparação a solos de cerrado (Silva & Leitão Filho 1982). É sabido que o alumínio abaixa o pH dos solos e, em condições ácidas, os nutrientes tornam-se menos disponíveis às plantas devido à redução de sua solubilidade (Goodland 1971). O alumínio diminui diretamente a disponibilidade de fosfato e potássio, nutrientes críticos, e também retém o cálcio, o cátion nutriente mais abundante, advindo desse fato uma adicional e crescente acidez (Goodland & Ferri 1979). Uma vez que a influência do alumínio sobre as plantas é principalmente indireta, a concentração de íons alumínio no solo não é o melhor índice de sua toxidez. O percentual de saturação de alumínio no solo (m), dado pela relação m = (Al/SB+Al) x 100 (Raij 1983), é o índice da toxidez do alumínio mais utilizado (Goodland & Ferri 1979). De fato, ao se comparar o pH dos solos analisados, não se notou diferença significativa entre os mesmos (3,7 e 3,9 para mata e cerrado, respectivamente), mas a saturação de alumínio foi maior no solo do cerrado (m = 78%), um indicativo da menor fertilidade deste em comparação ao solo da mata (m = 62% -

tabela 2). Esta diferença, entretanto, parece não afetar a produção de flavonóides e de fenóis nesta espécie.

Tabela 1.
Produção de flavonóides totais e fenóis totais (% peso seco) em folhas de Pyrostegia venusta em função do biócoro.

n = 10 indivíduos para cada biócoro

*Média ± erro padrão

No universo da coevolução de plantas e insetos, um novo tipo de repelente confere à planta uma vantagem competitiva e permite a expansão evolutiva de um novo grupo. Sob este ângulo, os alcalóides isoquinolínicos de Magnoliidae deram lugar a taninos de Hamamelidae, Rosidade e Dilleniidae e estes, por sua vez, a compostos iridoidais que foram explorados mais eficientemente por Asteridae (Cronquist 1977). De fato, Rosidae-Asteridae, a maior linha evolutiva das dicotiledôneas (Cronquist 1968), apresenta um padrão de distribuição de metabólitos secundários caracterizado por uma mudança progressiva de taninos e cristais a defesas baseadas apenas em outros metabólitos (alcalóides, glicosídeos cianogênicos, óleos essenciais, poliacetilenos, saponinas, etc). Nos grupos mais primitivos de Rosidae (sensu Cronquist 1968 e Takhtajan 1969), cristais e taninos condensados e hidrolisáveis são ubíquos. Já grupos mais evoluídos de Rosidae retém seus cristais, mas demonstram uma tendência à perda de um ou ambos os tipos de tanino. A frequência e diversidade de metabólitos secundários apresentadas por famílias de Asteridae é muito maior (Gardner 1977). A correlação entre o hábito arbóreo e a presença de taninos, um dos principais indicativos de primitividade, é nítida no caso de Rosidae. Taninos são considerados defesas características de plantas aparentes, agindo como bar-reiras quantitativas (Feeny 1975), em contraposição a defesas qualitativas, associadas ao porte herbáceo. Trabalhos clássicos de distribuição de taninos em dicotiledôneas surgiram, principalmente, nas dé-cadas de 50 e 60 (por exemplo, Bate-Smith & Metcalfe 1957, Bate-Smith 1962). Mole (1993), numa revisão sobre estes dados, observou que um menor número de famílias é caracterizado pela presença típica de taninos mas a perda destes compostos com o avanço evolutivo permaneceu como regra. Segundo Cronquist (1981), a família Bignoniaceae (Asteridae), a qual P. venusta pertence, tem raros representantes taníferos. No presente trabalho, não foram detectados taninos nas folhas dessa espécie, o que está coerente com a ausência, via de regra, de taninos em espécies herbáceas (Bate-Smith & Metcalfe 1957, Bate-Smith 1962, Mole 1993). Os valores obtidos para fenóis totais (1,72% ± 0,14 e 1,87% ± 0,11, mata e cerrado, respectivamente - tabela 1) estão próximos ao valor encontrado para outra espécie da mesma família, Markhamia platycaly, com 2,04%, sendo valores muito baixos, se comparados a uma espécie de Rosaceae, Paraminari excelse, com 10,54% (Gartlan et al. 1980), espécie pertencente a um grupo tipicamente tanífero.

Para o estudo de flavonóides, optou-se pela análise quantitativa, em detrimento da análise qualitativa, por ser um tema pouco explorado tanto do ponto de vista quimiossistemático quanto ecológico, e que tem trazido inúmeras contribuições nestas áreas. O espectro de possibilidades em estudos de fatores ecológicos relativos à composição flavonoídica é imenso. Bohm (1987) chama a atenção para o fato de diferenças quantitativas no perfil flavonoídico representarem categorias de variações intraespecíficas tão importantes quanto as diferenças qualitativas.

Vários fatores ambientais influenciam a produção de flavonóides nas plantas, como, por exemplo, infecção, temperatura, nutrição, injúria, metabolismo do açúcar e do nitrogênio e qualidade de radiação (Blank 1947). A radiação solar é um dos fatores que, via de regra, está relacionada à variação quantitativa. Muitos trabalhos demonstraram que há um aumento quantitativo de flavonóides em órgãos expostos à luz, em comparação com aqueles que estão à sombra (Hillis & Swain 1959, Trouchet 1966 e 1967 apud Bohm 1987, Holst 1977). Com relação a fatores edáficos, a maioria dos trabalhos com flavonóides envolve a análise de pigmentos florais, havendo diferenças qualitativas nos perfis flavonoídicos das plantas provenientes de diferentes solos (Pollock et al. 1967, Horovitz 1976, Menadue & Crowden 1983). O perfil quantitativo de flavonóides de P. venusta não é influenciado por diferenças de ambiente, representadas aqui de forma genérica por mata e cerrado e tampouco por diferenças edáficas (tabelas 1 e 2).

Tabela 2.
Análise química de uma amostra de terra coletada na mata e no cerrado. MO = matéria orgânica, H + Al = acidez potencial, SB = soma de bases, T = capacidade de troca iônica, V = saturação de bases, m = saturação de Al

Fonte: Laboratório de Análises de Solos, Dep. de Ciência do Solo, ESALQ

O interesse pela química de Bignoniaceae foi motivado pela comprovação de diversas atividades biológicas e farmacológicas do lapachol (prenilnaftoquinona) e de vários de seus produtos de transformações biossintéticas ou químicas (Gottlieb & Mors 1980), sendo Tabebuia o gênero mais estudado (Gottlieb 1982). No tocante aos flavonóides, poucas espécies têm sido estudadas no Brasil. Blatt et al. (1996 e 1998) analisaram o perfil flavonoídico de Arrabidaea brachypoda e Pyrostegia venusta (tribo Bignonieae) e Jacaranda decurrens, Tabebuia caraiba e T. ochracea (tribo Tecomeae). Outra espécie da tribo Bignonieae, Arrabidaea chica, tem sido estudada por Takemura (1993) e Takemura et al. (1995).

Num dos raros estudos de quimiossistemática de Bignoniaceae baseada em flavonóides, Harborne (1967) encontrou um predomínio de flavonas sobre flavonóis nas 16 espécies por ele analisadas. Já Blatt et al. (1996 e 1998), encontraram predomínio de flavonóis sobre flavonas, inclusive quantitativamente, nas espécies de cerrado analisadas. T. caraiba e T. ochracea são arbóreas enquanto A. brachypoda e J. decurrens são herbáceas e P. venusta é trepadeira, com perfis flavonoídicos diversos do padrão estabelecido por Harborne (1977).

A ocorrência de uma flavona, a 6-hidroxiluteolina, na família foi detectada por Harborne (1967), sendo comum na tribo Tecomeae e ausente em Bignonieae. Blatt et al. (1996 e 1998) também verificaram que essa flavona está presente em J. decurrens, T. caraiba e T. ochracea pertencentes à tribo Tecomeae e ausente em A. brachypoda e P. venusta da tribo Bignonieae. Além disso, estas duas últimas espécies apresentaram uma menor diversificação estrutural de flavonóides, com P. venusta apresentando apenas rutina, em quantidade não significativa (Blatt et al. 1998).

O baixo teor de fenóis em P. venusta pode ser explicado, portanto, pela ausência de taninos e pela presença não significativa de flavonóides. Como as naftoquinonas são bastante representativas em Bignoniaceae, considera-se como bastante provável estar ocorrendo uma substituição dos compostos fenólicos por esta classe de compostos de defesa. Além disso, deve-se ressaltar que as diferenças de porcentagem de saturação de alumínio (m, na tabela 2) entre os solos de mata e de cerrado, que indicam menor fertilidade neste último, parecem não influenciar a produção de fenóis e de flavonóides nesta espécie, podendo se considerar a ausência de plasticidade fenotípica baseada nesses caracteres.

Agradecimentos - As autoras são gratas à FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, Processo nº 95/7023-6) e ao CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, Processo no 300726/93-7) pela concessão de bolsas durante a realização do presente trabalho.

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². Estagiária de Iniciação Científica, Seção de Fisiologia e Bioquímica de Plantas, IBt, bolsista FAPESP.

³. Seção de Fisiologia e Bioquímica de Plantas, Instituto de Botânica, Caixa Postal 4005, 01061-970 São Paulo, SP, Brasil. Bolsista CNPq.

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1

. Monografia apresentada por M.D. dos Santos à UNISA (Universidade Santo Amaro) para obtenção do título de Bacharel em Ciências Biológicas.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  21 Dez 1998
• Data do Fascículo
  Ago 1998

Histórico

• Aceito
  09 Dez 1997
• Recebido
  27 Jun 1997