Ação do extrato metanólico e etanólico de Davilla elliptica St. Hill. (Malpighiaceae) na resposta imune

Action of Davilla elliptica St. Hill. (Malpighiaceae) methanolic and ethanolic extracts in the immune response

Resumos

Plantas têm contribuído no tratamento da maioria das doenças. Considerando a importância terapêutica das plantas medicinais, foi avaliada a atividade imunológica dos extratos metanólico e etanólico de Davilla elliptica. Macrófagos estão envolvidos em todos estágios da resposta imune, podendo liberar componentes como: peróxido de hidrogênio (H2O2), óxido nítrico (NO) e fator de necrose tumoral-alfa (TNF-alfa). A estimulação dos macrófagos foi avaliada pela determinação de H2O2, NO e TNF-alfa em culturas de macrófagos peritoneais de camundongos na presença dos extratos da D. elliptica. IC50 foi determinado através de ensaio utilizando MTT. Os estudos fitoquímicos realizados mostraram a presença de flavonóides derivados da quercetina e miricetina entre outros compostos. A produção de H2O2 não foi muito expressiva em ambos extratos, contudo a de NO foi significativa. Os dois extratos induziram a produção de TNF-alfa, sendo que a liberação dessa citocina pelo extrato metanólico foi quase cinco vezes maior do que pelo extrato etanólico. Uma relação entre as sínteses de NO e TNF-alfa foi observada. O aumento na produção de NO está relacionado com a indução de citocinas pró-inflamatórias como TNF-alfa. Analisando os resultados, sugere-se que os extratos metanólico e etanólico de D. elliptica podem modular a ativação de macrófagos.

Davilla elliptica; macrófagos; peróxido de hidrogênio; óxido nítrico; fator de necrose tumoral-alfa

Plants have contributed in a significant way to the treatment of most of the diseases. Considering the therapeutic importance of the medicinal plants, the immunological activity of the methanolic and ethanolic extract of Davilla elliptica was evaluated. In every stage of the immune response macrophages are involved and they can release many compounds such as hydrogen peroxide (H2O2), nitric oxide (NO) and tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha). Macrophages stimulation was evaluated by the determination of H2O2, NO and TNF-alpha in peritoneal macrophages cultures of mice in the presence of the D. elliptica extracts. IC50 was determined by MTT assay. The phytochemical study showed flavonoids derived from quercetin and myricetin and other compounds. The production of H2O2 was not very expressive in both extracts, but they presented a significant effect on NO production. The two extracts induced TNF-alpha production, although the methanolic liberated almost five times more TNF-alpha than the ethanolic one. A relationship among the synthesis of NO and TNF-alpha was observed. The increase of NO production is related with the induction of proinflammatory cytokines like TNF-alpha. Analyzing the results, it is suggested that methanolic and ethanolic extract of D. elliptica can modulate macrophage activation.

Davilla elliptica; macrophages; hydrogen peroxide; nitric oxide; tumor necrosis factor-alpha

ARTIGO

Ação do extrato metanólico e etanólico de Davilla elliptica St. Hill. (Malpighiaceae) na resposta imune

Action of Davilla elliptica St. Hill. (Malpighiaceae) methanolic and ethanolic extracts in the immune response

I.Z. Carlos^I*; F.C.M. Lopes^I; F.P. Benzatti^I; C.B.A. Carli^I; M.F. Marques^I; C.M. Jordão Junior^II; D. Rinaldo^III; T.R. Calvo^III; L.C. Santos^III; W. Vilegas^III

^IDepartamento de Análises Clínicas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade Estadual Paulista, Caixa Postal 502, 14801-902, Araraquara, SP, Brasil

^IIDepartamento de Ciências Biológicas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade Estadual Paulista, 14801-902, Araraquara, SP, Brasil

^IIIDepartamento de Química Orgânica, Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, Caixa Postal 355, 14801-970, Araraquara, SP, Brasil

RESUMO

Plantas têm contribuído no tratamento da maioria das doenças. Considerando a importância terapêutica das plantas medicinais, foi avaliada a atividade imunológica dos extratos metanólico e etanólico de Davilla elliptica. Macrófagos estão envolvidos em todos estágios da resposta imune, podendo liberar componentes como: peróxido de hidrogênio (H₂O₂), óxido nítrico (NO) e fator de necrose tumoral-a (TNF-a). A estimulação dos macrófagos foi avaliada pela determinação de H₂O_2, NO e TNF-a em culturas de macrófagos peritoneais de camundongos na presença dos extratos da D. elliptica. IC₅₀ foi determinado através de ensaio utilizando MTT. Os estudos fitoquímicos realizados mostraram a presença de flavonóides derivados da quercetina e miricetina entre outros compostos. A produção de H₂O₂ não foi muito expressiva em ambos extratos, contudo a de NO foi significativa. Os dois extratos induziram a produção de TNF-a, sendo que a liberação dessa citocina pelo extrato metanólico foi quase cinco vezes maior do que pelo extrato etanólico. Uma relação entre as sínteses de NO e TNF-a foi observada. O aumento na produção de NO está relacionado com a indução de citocinas pró-inflamatórias como TNF-a. Analisando os resultados, sugere-se que os extratos metanólico e etanólico de D. elliptica podem modular a ativação de macrófagos.

Unitermos: Davilla elliptica, macrófagos, peróxido de hidrogênio, óxido nítrico, fator de necrose tumoral-a.

ABSTRACT

Plants have contributed in a significant way to the treatment of most of the diseases. Considering the therapeutic importance of the medicinal plants, the immunological activity of the methanolic and ethanolic extract of Davilla elliptica was evaluated. In every stage of the immune response macrophages are involved and they can release many compounds such as hydrogen peroxide (H₂O₂), nitric oxide (NO) and tumor necrosis factor-a (TNF-a). Macrophages stimulation was evaluated by the determination of H₂O_2, NO and TNF-a in peritoneal macrophages cultures of mice in the presence of the D. elliptica extracts. IC₅₀ was determined by MTT assay. The phytochemical study showed flavonoids derived from quercetin and myricetin and other compounds. The production of H₂O₂ was not very expressive in both extracts, but they presented a significant effect on NO production. The two extracts induced TNF-a production, although the methanolic liberated almost five times more TNF-a than the ethanolic one. A relationship among the synthesis of NO and TNF-a was observed. The increase of NO production is related with the induction of proinflammatory cytokines like TNF-a. Analyzing the results, it is suggested that methanolic and ethanolic extract of D. elliptica can modulate macrophage activation.

Keywords: Davilla elliptica, macrophages, hydrogen peroxide, nitric oxide, tumor necrosis factor-a.

INTRODUÇÃO

Considerada em tempos remotos como uma manifestação divina, a utilização de plantas medicinais é tão antiga quanto a própria civilização (Yamada, 1998).

O potencial das plantas superiores como fonte de medicamentos é pouco explorado, estima-se a existência de 250.000-500.000 espécies de plantas no mundo, sendo que o estudo fitoquímico foi realizado em apenas uma minúscula parcela (Hamburger; Hostettmann, 1991).

Muitas plantas usadas na medicina tradicional demonstraram modular a resposta imunológica (Agarwal; Singh, 1999). Davilla elliptica St. Hill. (Malpighiaceae) é uma árvore pequena que cresce no cerrado do Brasil. Esta planta, conhecida como Cipó-caboclo e Pau-de-bugre, é utilizada como tônico, adstringente e laxante por populações locais (Rodrigues et al, 2002; Rodrigues; Carvalho, 2001).

Os macrófagos são as primeiras células a participar da resposta imunológica e podem ser ativados por uma variedade de estímulos. Sua principal função inclui a fagocitose de partículas estranhas, a apresentação de antígenos, a produção de citocinas e espécies reativas de oxigênio (H2O2) e nitrogênio (NO) (Johnston, 1988). Estudos recentes também sugerem que o H2O2 possui um importante papel nas funções do macrófago (Puri et al., 1993; Ramasarma, 1990). Os produtos do burst oxidativo são usados para matar patógenos fagocitados e para destruir outras células. Além do H2O2 e ânion superóxido (O2*-), dois outros produtos altamente reativos derivados do oxigênio que participam do processo de destruição de patógenos são o radical hidroxila (×OH) e oxigênio singlet (1O2*). Essa seqüência coordenada de reações bioquímicas é iniciada por um aumento no consumo de oxigênio, seguido da redução de um elétron do O2, originando o ânion superóxido (O2*-). NADPH (nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzida) ou NADH (nicotinamida adenina dinucleotídeo) são utilizados como doadores de elétrons em uma reação catalizada pela NADPH oxidase. O2*- é subseqüentemente convertido para H2O2 (Pick; Keisari, 1980; Pick; Mizel, 1981).

O NO é uma molécula que possui uma grande variedade de funções e atua em muitos processos fisiológicos, entre eles na regulação do sistema imune (Halliwell; Gutteridge, 1984; Kiechle; Malinski, 1993). Além disso, essa molécula também faz parte do arsenal de primeira defesa do organismo com poder microbicida. Assim, está demonstrada sua ação antibacteriana, antiviral e antiparasitária (Flora Filho; Zilberstein, 2000).

Redes complexas de citocinas interagem de um modo dinânico para regular as respostas imunes e outras funções biológicas (Ollier, 2004). Dentre as citocinas, encontra-se o TNF-a, que foi purificada, seqüenciada e teve seu gene clonado em meados dos anos 80. Desde então, várias propriedades atribuídas a essa citocina têm sido demonstradas (Eigler et al., 1997). É uma citocina multifuncional que possui funções centrais na inflamação aguda e crônica, na resposta antitumoral e nas infecções (Palladino et al., 2003). O TNF-a age no crescimento de fibroblastos (Vilcek et al., 1986; Beutler; Cerami, 1989) e apresenta atividade citotóxica induzindo reativos intermediários do oxigênio, não somente em macrófagos e polimorfonucleares, mas também em células cancerígenas (Zimmerman et al., 1989). É quimiotático para neutrófilos (Shalaby et al., 1985; Postelthwaite; Seyer, 1990) e ajuda na proliferação e diferenciação de células B humanas (Jelinek; Lipsky, 1987), interferindo no processo de citodiferenciação e de proliferação celular. Também age sinergisticamente com a interleucina-1 (IL-1) na ativação osteoclástica, associado à liberação da prostaglandina-E₂ (Vassalli, 1992).

As plantas produzem um vasto número de substâncias naturais com potencial antimicrobiano e imunomodulador na tentativa de se adaptarem às agressões do meio ambiente. Entre essas substâncias estão os flavonóides, polifenóis encontrados em plantas e presentes em grande quantidade na dieta humana. Esses compostos possuem várias atividades biológicas, incluindo propriedades imunomodulatórias e atividades antioxidantes (Ielpo et al., 2000).

O objetivo do presente estudo foi determinar a liberação do H₂O₂, NO e TNF-a em culturas de macrófagos peritoneais na presença dos extratos metanólicos e etanólicos obtidos das folhas de Davilla elliptica.

MATERIAL E MÉTODOS

Material vegetal

Folhas de Davilla elliptica foram coletadas no Porto Nacional, Estado do Tocantins, Brasil e identificadas por Eduardo Ribeiro dos Santos. Uma exsicata (4583) foi depositada no Herbário da Universidade do Tocantins.

Preparação dos extratos metanólico e etanólico

Os extratos metanólico e etanólico foram preparados, separadamente a partir de 1000 g das folhas de Davilla ellipitca, secas ao ar livre e moídas. Sobre o material vegetal foi vertido, 4L de metanol ou etanol em um galão de vidro de 5L, em seguida, os galões foram hermeticamente fechados e deixados sob maceração por uma semana. As misturas foram filtradas em papel-filtro. Após a primeira extração, os procedimentos foram repetidos. As concentrações dos extratos foram feitas em evaporador rotativo sob pressão reduzida, fornecendo 142,4g do extrato metanólico (rendimento de 14,24%) e 186,9g do extrato etanólico ( rendimento de 18,7%).

Triagem fitoquímica

As análises cromatográficas foram feitas em placas de sílica gel (Macherey Nagel) eluídas em diferentes sistemas de solventes tolueno/acetato de etila 8:2 (v:v) e clorofórmio/metanol/n-propanol/água, 5:6:1:4 (v:v:v:v) e clorofórmio/metanol 85:15 (v:v)

Os flavonóides foram identificados por sua coloração intensa em luz UV (254 nm) quando revelados com NP/PEG no sistema de solventes clorofórmio/metanol (85:15, v:v) (Wagner et al., 1984). Foram utilizados também padrões autênticos (Sigma) dos flavonóides existentes em nosso laboratório (quercetina, kaempferol e miricetina).

Os testes para taninos foram realizados segundo os procedimentos descritos por Simões et al. (2001) na reação com a gelatina e Schneider (1990) na reação com sais de ferro.

Utilizou-se também, vapores de iodo e soluções de CeSO₄ (saponinas e terpenóides), Iodoplatinato (alcalóides), vapores de amônia (antraquinonas e cumarinas) e anisaldeído/ácido sulfúrico (flavonóides, saponinas, terpenos, esteróides, ácidos gálico e catequinas) (Wagner et al., 1984).

Preparação dos extratos para o ensaio imunológicos

As folhas da planta, secas e em po (1.0 kg) foram extraidas com metanol ou etanol em temperatura ambiente por uma semana. Os solventes foram evaporados a 60ºC sob pressao reduzida. Apos, os extratos foram dissolvidos em dimetilsulfoxido (DMSO) e em seguida diluidos em meio de cultura (RPMI-1640). Nenhuma das amostras continha mais que 1% de DMSO. Todos os extratos foram testados na mesma concentracao (250 mg/mL).

Animais

Camundongos Swiss (6-8 semanas, pesando entre 18 a 25 g), fornecidos pela Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade Estadual Paulista, Araraquara, SP, Brasil, foram mantidos em gaiolas de policarbonato, com água e ração (Purina) ad libitum, em local climatizado(23 ± 1ºC, 55 ± 5%, 10-18 circulação/h) com controle de claro e escuro a cada período de 12-h.

Células do exsudato peritoneal

Os camundongos foram inoculados com 3mL de tioglicolato de sódio 3% três dias antes do experimento. As células do exsudato peritoneal (PEC) foram coletadas dos animais usando 5mL de PBS estéril, pH 7.4. As células foram lavadas duas vezes e centrifugadas 200 g por 5 min a 4°C e ressuspendidas em meio apropriado para cada teste.

Determinação de H₂O₂

PEC (2 X 10⁶ células/mL) foram obtidas como descrito anteriormente e ressuspendidas em uma solução contendo 140 mmol NaCl, 10 mmol de tampão fosfato de potássio (pH 7.0), 5.5 mmol dextrose, 0.56 mmol vermelho de fenol, e 0.01 mg/mL peroxidase de raiz forte tipo II (Sigma). Em seguida, 100mL dessa suspensão foi transferida para microplacas de 96 cavidades e exposta a 50mL dos extratos. Solução de Zimosan em tampão fosfato foi usado como controle positivo. As células foram incubadas por 1 hora em estufa a 37°C com 7,5% CO₂ (Forma Scientific). A reação foi interrompida com 50mL de NaOH 4N e, a seguir, foram feitas leituras em espectrofotômetro UV/Visível de microplacas (Labsystems) a 620 nm contra um branco contendo solução vermelho de fenol e 4 N NaOH. Os resultados foram expressos em nanomoles de H₂O₂/2 x 10⁵ células peritoneais, a partir de curva-padrão previamente estabelecida para cada teste, constituída de concentrações molares conhecidas de H₂O₂ em tampão vermelho de fenol (Pick; Keisari, 1980; Pick; Mizel, 1981).

Determinação de óxido nítrico (NO)

PEC (5x10⁶ células/mL) foram ressuspendidas em meio RPMI-1640 completo (Sigma) contendo 100 U/mL penicilina, 100 mg/mL estreptomicina, 5x10^-2 M mercaptoetanol e 5% de soro fetal bovino (Gibco, USA). 100ìL dessa suspensão foi distribuída em placas de 96 cavidades estéreis e incubada com 100 mL dos diferentes extratos por 24 h a 37ºC em estufa com tensão constante de 7,5% de CO₂. Lipopolissacarídeo (LPS- Escherichia coli O111:B4) foi usado como controle positivo. Após incubação, alíquotas de 50 mL do sobrenadante de cada amostra foram adicionadas a 50 mL do reagente de Griess (1% sulfanilamida, 0.1% naftiletilenodiamina e 3% H₃PO₄) e incubados por 10 min em temperatura ambiente. A reação foi lida a 540 nm em espectrofotômetro UV/Visível de microplacas (Labsystems). O resultado foi expresso em mmols de NO por 5x 10⁵ células através de curva-padrão obtida anteriormente com concentrações molares conhecidas de NaNO₂ (Green et al., 1982).

Determinação da produção de TNF-a

Para a produção de TNF-a, PEC aderentes foram estimulados com 34 ml dos extratos da planta. LPS foi usado como controle positivo. Após 24 h, os sobrenadantes foram removidos, centrifugados em centrífuga refrigerada (Hettich Zentrifugen) a 7800 x g, colocados em eppendorfs e estocados a -80 °C até a realização do bioensaio. Células tumorais de camundongos da linhagem L929 foram utilizadas para medir os níveis de TNF-a nos sobrenadantes das culturas (Carswell et al., 1975). Células L929 em meio RPMI-1640 contendo 5% de soro fetal bovino (Sigma) foram colocadas em microplacas (Corning) (4 x 10⁴células/por orifício) e incubadas overnight a 37°C em estufa com 7,5% de CO₂ (Forma Scientific). Os sobrenadantes da cultura (100 ml), em triplicata, foram incubados com 1.0 mg de actinomicina D mL^-1 (Sigma) (100 ml). No dia seguinte, a viabilidade das células L929 foi avaliada fixando-as com violeta cristal (0.2 % em 20 % metanol) e dissolvendo as células coradas com 0,1mL de lauril sulfato de sódio 1 % por orifício. A absorbância foi lida a 490nm leituras em espectrofotômetro UV/Visível de microplacas (Labsystems). As unidades de TNF-a foram calculadas usando curva padrão obtida anteriormente com TNF-a recombinante. Para confirmar a presença de TNF-a nos sobrenandantes das culturas, essas preparações foram previamente incubadas com soro imune de coelho anti TNF-a (Carlos et al., 1994).

Análise estatística

A análise estatística foi realizada através do teste-t de Student (Microcal Origin 5.0). O nível de significância foi de 5%.

RESULTADOS

Inicialmente, a triagem fitoquímica dos dois extratos indicou a presença de flavonóides, triterpenos, esteróides, ácido gálico e catequinas (Tabela 1). Flavonóides derivados da quercetina e da miricetina com uma unidade de açúcar estão presentes (manchas com Rf ~ 0,3 e ~02 no sistema de solventes clorofórmio:metanol 85:15, v:v).

Posteriormente, foram realizados os testes imunológicos. Os extratos metanólico e etanólico de D. elliptica não produziram quantidades expressivas de peróxido de hidrogênio (H₂O₂) (Figura 1), contudo ambos mostraram uma moderada liberação de óxido nítrico, aproximadamente 28 mmols (Figura 2). O extrato etanólico mostrou uma moderada produção de TNF-a (39,5 unidades/mL), mas o extrato metanólico induziu uma liberação maior (143,2 unidades/mL) (Figura 3).

O efeito citotóxico dos extratos foi avaliado pela determinação do 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-brometo de difeniltetrazólio (MTT) como descrito anteriormente por Mossman (1983). O índice de citotoxicidade 50 (IC₅₀) encontrado foi superior a 300mg/mL (dados não mostrados).

DISCUSSÃO

Nosso grupo investiga plantas brasileiras usadas na medicina popular. Foram realizados estudos imunológicos e fitoquímicos dos extratos metanólico e etanólico de Davilla elliptica.

O gênero Davilla possui a seguinte composição fitoquímica: açúcares, taninos e flavonóides como quercetina, miricetina, quercetina-3-O-a-L-ramnosídeo e miricetina-3-O-a-L-ramnosídeo (David et al., 1996). Baseado na triagem fitoquímica realizada com os extratos etanólico e metanólico das folhas de D. elliptica, observou-se que flavonóides derivados da quercetina e da miricetina com uma unidade de açúcar estão presentes, além de outras classes de compostos existentes, conforme Tabela 1.

Os ensaios imunológicos mostraram que a produção de H2O2 não foi muito expressiva nos dois extratos, embora uma pequena quantidade seja um resultado importante. Sob condições fisiológicas normais, o H₂O₂ é gerado em pequenas quantidades e é rapidamente utilizado ou degradado, mas longas exposições a altas concentrações deste mediador podem destruir estruturas biológicas e levar a um dano celular irreversível. O H2O2 é tóxico para as células e é também responsável pela morte das bactérias fagocitadas (Ramasarma, 1990).

Neste trabalho, os resultadosmostraram que os extratos metanólico e etanólico estimularam a produção de NO e TNF-a por macrófagos murinos. O NO está envolvido na morte ou inibição da proliferação de microrganismos, destruição de células tumorais por macrófagos ativados e na defesa inespecífica do hospedeiro (Stuehr; Nathan, 1989; Hibbs et al., 1987). Além disso, estudos recentes demonstraram que macrófagos murinos estimulados com TNF-a produziram NO via expressão da indução do gene da óxido nítrico sintase, e acredita-se que reativos intermediários do nitrogênio assim produzidos desempenhem um papel significante nas atividades tumoricida e microbicida (Xie et al., 1992; Lorsbach et al, 1993).

Ambos os extratos induziram a produção de TNF-a, embora o extrato metanólico liberou uma maior quantidade desse mediador comparado com o extrato etanólico. O exato mecanismo pelo qual o extrato metanólico da D. elliptica induziu quase cinco vezes mais TNF-a que o extrato etanólico e a identificação de outros componentes importantes nesse extrato ainda precisam ser elucidados.

O extrato da planta Echinacea purpurea tem sido largamente utilizado como um estimulante do sistema imune e estudos in vitro mostraram que essa planta pode aumentar a produção de IL-1, IL-6 e TNF-a pelos macrófagos (Burger et al., 1997).

Platycodon grandiflorum, planta da medicina tradicional oriental, estimula a proliferação de macrófagos, a fagocitose, a atividade citostática e produção de óxido nítrico de maneira dose-dependente. A produção de citocinas tais como TNF-a, IL-1b e IL-6 foram aumentadas, sugerindo que P. grandiflorum é um potente estimulante da função dos macrófagos (Chul et al., 2001).

Silimarina é uma mistura de flavonóides bioativos isolados da Silybum marianum. Testes utilizando camundongos tratados com silimarina mostram que ocorre uma supressão da função dos linfócitos T quando baixas doses são utilizadas, contudo uma estimulação do processo inflamatório ocorre com o uso de altas doses (Johnson et al., 2003).

Estes dados são promissores, porém métodos preparativos rápidos são necessários para o fornecimento de quantidades suficientes de compostos com o intuito de realizar testes farmacológicos in vivo com compostos isolados ou frações enriquecidas. Além disso, é possível que os resultados encontrados nesse estudo sejam devidos a ação dos flavonóides derivados da quercetina e da miricetina, contudo testes futuros utilizando os flavonóides isolados da planta são necessários.

No presente trabalho, a análise dos resultados sugere que ambos extratos da D. elliptica podem modular a ativação dos macrófagos. O efeito imunoestimulatório observado pode ser benéfico no aumento da imunidade em doenças infecciosas.

AGRADECIMENTOS

Agradecemos Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo financiamento do Programa Biota-Fapesp e a Marisa Campos Polesi Placeres, técnica do Laboratório de Imunologia Clínica.

Recebido em 29/10/04

Aceito em 08/01/05

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  17 Jun 2008
• Data do Fascículo
  Mar 2005

Histórico

• Recebido
  29 Out 2004
• Aceito
  08 Jan 2005