Rubrofusarina, um policetídeo natural inibidor da topoisomerase II-α humana

Rubrofusarin, a natural polyketide as new human topoisomerase II-α inhibitor

ARTIGO

Rubrofusarina, um policetídeo natural inibidor da topoisomerase II-α humana

Rubrofusarin, a natural polyketide as new human topoisomerase II- α inhibitor

Alexsandro Branco^{I, *}; Angelo C. Pinto^II; Raimundo Braz-Filho^III; Edson F. Silva^IV; Noema F. Grynberg^IV; Aurea Echevarria^IV

^IDepartamento de Saúde, Universidade Estadual de Feira de Santana, Av. Universitária s/n, BR 116 - Km 03, Campus Universitário, 44031-460 Feira de Santana-BA, Brasil

^IIInstituto de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro,Centro de Tecnologia, 21945-970 Rio de Janeiro-RJ, Brasil

^IIISetor de Química de Produtos Naturais, LCQUI-CCT, Universidade Estadual do Norte Fluminense, 28015-620 Campos dos Goitacazes-RJ, Brasil

^IVDepartamento de Química, Instituto de Ciências Exatas, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, 23851-970 Seropédica-RJ, Brasil

RESUMO

Este trabalho descreve o efeito inibitório de rubrofusarina (5,6-diidroxi-8-metoxi-2-metilbenzo[g]cromen-4-ona, 1) sobre a enzima DNA topoisomerase II-α humana. Rubrofusarina mostrou total inibição da enzima topisomerase II-α na concentração de 120 µM. Este resultado é semelhante ao observado com etoposida, utilizada como controle positivo. Para a realização deste teste, rubrofusarina foi isolada de Senna macranthera var. nervosa (Voguel) Irwin & Barnebyem e caracterizada por métodos espectroscópicos, incluindo RMN 2D, do produto natural bem como de seu derivado monoacetilado.

Unitermos: Rubrofusasina, topoisomerase, Senna macranthera, Fabaceae.

ABSTRACT

This work describes the inhibitory effect of rubrofusarin (5,6-dihydroxy-8-methoxy-2-methylbenzo[g]cromen-4-one, 1) against human DNA topoisomerase II-α. The results for relaxation assays showed total inhibition of topisomerase II-α by rubrofusarin at 120 µM. This result is comparable to the one observed with etoposide as positive control. For this study, rubrofusarin was isolated from Senna macranthera var. nervosa (Voguel) Irwin & Barnebyem and characterized by spectral data, including 2D NMR, as well as its acetylated derivative.

Keywords: Rubrofusarin, topoisomerase, Senna macranthera, Fabaceae.

INTRODUÇÃO

As topoisomerases são enzimas nucleares que controlam e modificam o estado topológico do DNA. Estas enzimas nucleares são classificadas em tipo I e II, de acordo com seus mecanismos e propriedades físicas, em células de mamíferos. A topoisomerase II (Topo II), dímero de tamanho aproximado de 170 kDa e existente nas isoformas α ou β, é responsável pela quebra da fita dupla de DNA levando a eventos como liberação da fita de DNA enovelada, transcrição, condensação dos cromossomos e recombinação (Sampaio et al., 2006; Hande, 2006). As topoisomerases, durante a proliferação celular, participam da manutenção e replicação do DNA. Quando estas funções são desativadas, as células ficam vulneráveis. Além disso, em tecidos tumorais a expressão das DNA-Topo I e II é maior do que nas células de metabolismo normal (Kellner et al., 2000). Assim, as topoisomerases são alvos importantes no desenvolvimento de novas drogas, principalmente para as que apresentam atividade anticâncer e antiviral (De Vita Jr et al., 1997).

Na medicina destacam-se os compostos das classes das antraciclinas e das epipodofilotoxinas como potentes inibidores da topoisomerase II. Estes compostos agem inibindo a religação do DNA e induzem a ligação de proteínas em suas quebras, e constituem-se como parte integrante em quimioterapia de primeira linha para uma grande variedade de tumores sólidos e hematológicos (Sampaio et al., 2006). O etoposídeo, derivado semi-sintético da lignana podofilotoxina, apresenta papel importante no tratamento clínico como potente agente quimioterapêutico para uma variedade de tumores, incluindo carcinomas, câncer testicular e linfomas (Zhang et al., 1992). Na tentativa de descobrir novos inibidores da topoisomerase, diversas classes de produtos naturais têm sido testadas e descritas na literatura nos últimos anos. Dentre estas classes, podemos citar os flavonóides (Constantinou et al., 1995; Shi et al., 1995) e biflavonóides (Grynberg et al., 2002), diterpenos (Maciel et al., 2007) e triterpenóides (Wada et al., 1998), estilbenóides (Yamada et al., 2006), alcalóides (Woo et al., 1997; Prescott et al., 2007), naftodiantronas (Peebles et al., 2001), naftoquinonas (Ting et al., 2003; Phyta et al., 1998; Esteves-Souza et al., 2007) e binaftoquinonas (Cunha et al., 2006), derivados do núcleo cromano (Ishar et al., 2006), entre outras.

Rubrofusarina (Figura 1), pertencente a classe das nafto-γ-pironas, é um composto natural comumente encontrado em fungos e plantas do gênero Fusarium (Leeper & Staunton, 1984; Mock & Robbers, 1969) e Senna (Graham et al., 2004; Barbosa et al., 2004), respectivamente. Este composto foi descrito pela primeira vez em 1937 por Ashley e colaboradores como um componente do metabolismo secundário do fungo Fusarium culmorum, entretanto sua estrutura somente estabelecida em 1962, através de derivatizações químicas e análises espectrais utilizadas na época (Leeper & Staunton, 1984). No ano seguinte, foi descrita a síntese da dimetoxirubrofusarina a partir do cloreto do ácido 3,5-dimetoxi-benzóico (Shibata et al., 1963) e, em outro trabalho, a síntese biomimética de rubrofusarina serviu como modelo para reações de ciclisarção catalizada pela enzima policetídeo sintetase (Abell et al., 1986). Dentre as atividades biológicas descritas para rubrofusarina destacam as propriedades quelantes (Pereira et al., 1995), inibidora da enzima xantina oxidase e atividade antimicrobial (Song et al., 2004), atividade herbicida (Mata et al., 2003), ação estrogênica (El-Halawany et al., 2007).

Rhee et al. (2007) descrevem que um dos principais requisitos estruturais para a inibição da Topo II é a presença de um cromóforo-planar contendo de dois a quatro anéis aromáticos condensados. Substâncias com este tipo de cromóforo podem intercalar com o DNA, causando bloqueio ou erros na leitura enzimática durante o processo de replicação. Baseado neste requisito, a rubrofusarina (1) nos chamou atenção por apresentar o núcleo naftopirona, uma vez que esta característica estrutural pode conferir a este policetídeo capacidade inibitória da enzima topoisomerase.

Neste trabalho descrevemos o efeito inibitório de rubrofusarina (1) frente à enzima DNA topoisomerase II-α humana, usando como controle positivo a etoposida (3), derivado semi-sintético da lignana podofilotoxina (4), que apresenta papel importante no tratamento clínico como potente agente quimioterapêutico. Para a realização deste teste, rubrofusarina foi isolada das cascas do caule de S. macranthera e a sua estrutura identificada com base na análise dos dados espectrais (IV, EM e RMN 1D e 2D) do produto natural e de seu derivado monoacetilado, bem como pela comparação com dados da literatura.

MATERIAL E MÉTODOS

Procedimentos gerais

O ponto de fusão foi determinado em bloco de Koffler e não foi corrigido. O espectro de absorção na região de infravermelho foi registrado em espectrômetro Perkin-Elmer (modelo 1420), utilizando filme em pastilha comprimida de KBr. Os espectros de RMN 1D e 2D foram obtidos em aparelho Bruker 200 (¹H: 200 MHz; ¹³C: 50 MHz) e Bruker AC-300 (¹H: 300 MHz; ¹³C: 75 MHz). Os deslocamentos químicos foram medidos em valores adimensionais δ (ppm) e as constantes de acoplamento (J) medidas em Hertz (Hz). Foram utilizados CDCl₃ como solvente e tetrametilsilano como referência interna. O espectro de massas foi obtido por impacto de eletrônico (70 eV) em espectrômetro de massas VG 7070. Para cromatografia em camada delgada analítica (C.C.D.) foram utilizadas cromatoplacas em folhas de alumínio contendo sílica gel de fabricação Merck (PF ₂₅₄) e reveladas sob lâmpada de ultravioleta (comprimento de onda de 254 e 365 nm).

Material vegetal

As cascas do caule de um espécime de Senna macranthera var. nervosa (Vogel) Irwin & Barnebyem foram coletadas no Bairro de Barão Geraldo na cidade Campinas, estado de São Paulo, em novembro de 2000. A identificação botânica foi realizada pela bióloga Msc. Márcia Campos, do Jardim Botânico do Rio de Janeiro.

Obtenção de rubrofusarina (1)

As cascas (500 g) de S. macranthera foram secadas em estufa a temperatura aproximada de 60 °C. Depois de secas e desfiadas manualmente, este material foi deixado imerso em hexano durante 7 dias. Durante o processo de evaporação do solvente, à pressão reduzida e temperatura controlada em evaporador rotatório, observou-se na parte interna do balão a formação de um precipitado de coloração avermelhada. Após a evaporação de parte do solvente (80%), a solução extrativa em hexano foi deixada em repouso. Após 24 horas, observou-se a deposição de material de coloração avermelhada. O sobrenadante foi separado com auxilio de uma pipeta Pasteur e concentrado à pressão reduzida. Obteve-se 45,0 g de extrato. O material sólido de coloração avermelhada foi recristalizado com uma mistura de acetona e metanol (1:1), e forneceu a rubrofusarina 1 (2,1 g).

Rubrofusarina (1)

Sólido alaranjado; Pf 212-214 °C; IV ν cm^-1: 3388 (OH), 1659 (C=O), 1623, 1586 (anel aromático); RMN de ¹H (300 MHz, CDCl₃) e ¹³C (75 MHz, CDCl₃): ver Tabela 1; EM: 272 (M⁺ , 100 %), 243 (M-H-CO ou M-CO-H, 47 %) e 229 (M-CH₃-CO ou M-CO-CH₃, 15 %).

Acetilação de 1

À rubrofusarina (1, 20,5 mg) foi adicionada 5 mL de anidrido acético e DMAP em quantidade catalítica. A mistura reacional foi agitada, sob refluxo, durante 6 horas. Em seguida, foi adicionada água e a solução foi extraída em funil de separação com hexano (2 x). A fase orgânica foi secada com sulfato de sódio e, após filtração, concentrada sob pressão reduzida. Após sucessivas recristalizações obteve-se o composto monoacetilado 2 (16 mg). RMN ¹H (200 MHz, CDCl₃) e RMN ¹³C 50 MHz, CDCl₃): ver Tabela 1.

Teste de inibição da DNA Topo II-α

O experimento foi realizado com 2 unidades de topoisomerase II-α, para 0,125 mg de kDNA encadeado (DNA do cinetoplasto), por incubação (37 °C por 30 min.) em tampão tris 50 mM pH = 8,0, de acordo com as instruções da TOPOGEN (Columbus, OH, USA), ATP 10 mM, na ausência e na presença de várias concentrações de 1 (0 - 250 µM) e da etoposida (3) usada como controle positivo (Chen & Liu, 1994; Esteves-Souza et al., 2006).

Os resultados do ensaio foram analisados por eletroforese em gel de agarose 1%, e posteriormente corados com brometo de etídio, sendo a revelação feita por irradiação em transiluminador de UV e imediatamente fotografada com máquina digital.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O extrato em hexano das cascas de S. macranthera forneceu um precipitado de coloração avermelhada identificado como rubrofusarina (1). O espectro na região de IV de 1 apresentou bandas de absorção de grupos hidroxila (ν_max 3388 cm^-1), carbonila conjugada (ν_max 1659 cm^-1) e anel aromático (ν_max 1623 e 1586 cm^-1). Através da análise do espectro de RMN de ¹³C-Pendant, deduziu-se o deslocamento químico e o número de hidrogênios para cada carbono de 1 (Tabela 1). O espectro de massas mostrou o íon molecular de m/z 272 (M^•+, C₁₅H₁₂O₅), que juntamente com os dados obtidos pelo espectro de RMN de ¹h, levaram a expansão da respectiva fórmula molecular para [C]₈ [C=O] [CH]₄ [CH₃] [OCH₃] [OH]₂. A presença de hidroxila quelatogênica em C-5 foi atribuída ao sinal singleto em δ_H 15,95. O espectro de RMN 2D ¹Hx¹H-COSY revelou apenas acoplamentos entre H-7 e H-9.

A correta atribuição dos átomos de hidrogênio e de carbono nos espectros de RMN de ¹H e de ¹³C-Pendant, respectivamente, foram acompanhados pelos experimentos homonuclear 2D ¹Hx¹H-NOESY e heteronuclear 2D ¹Hx¹³C-COSY-ⁿJ_CH (n = 1, HMQC; n = 2 e 3 HMBC) de 1 (Tabela 1). O espectro HMBC mostrou que os hidrogênios H-7, H-9 e H-10 estão correlacionados a longa distância (³J_CH) com o carbono quaternário C-5a (δ_C 106,8), confirmando o sistema naftalênico da rubrofusarina (1). As demais correlações estão listadas na Tabela 1. O espectro homonuclear 2D ¹Hx¹H-NOESY mostrou interações espaciais dos hidrogênios de metoxila em 3,90 (s) com os hidrogênios em H-7 (δ_H 6,46; d, 2,2 Hz) e H-9 (δ_H 6,56; d, 2,2 Hz) e de metila em 2,40 (s) com o hidrogênio em H-3 (δ_H 6,01, s). Este espectro apresentou, também, sinal de interação de H-10 (δ_H 6,95, s) com o hidrogênio H-9.

Acetilação de rubrofusarina produziu o produto monoacetilado 2. O grupamento acetila em C-6 foi confirmado pelos sinais de grupo acetoxílico em δ_H 2,34 (s) e δ_C 170,3 (C=O) e 20,9 (CH₃) presentes nos espectros de RMN de ¹H e de ¹³C, respectivamente. Os dados espectrais obtidos indicam que a hidroxila quelatogênica em C-5 (δ_H 14,6) foi mantida. O espectro de RMN de ¹H de 2 quando comparado com 1 (Tabela 1) mostrou deslocamento paramagnético dos sinais em δ_H H-7 (δ_H 6,71; d, 2,2 Hz), H-9 (6,85; d, 2,2 Hz) e H-10 (δ_H 7,06, s), como consequência do efeito de desproteção do grupo acetoxílico. Os espectros de RMN de ¹³C (HBBD e DEPT com θ = 135º e 90º) mostraram os sinais correspondentes aos dezessete carbonos de 2 e permitiram verificar as modificações esperadas nos deslocamentos químicos correspondentes aos átomos de carbono localizados em posição orto [C-5a: Δδ_C = 109,7 (2) - 106,8 (1) = 2,9 ppm; CH-7: Δδ_C = 110,5 (2) - 100,7 (1) = 9,8 ppm] e para [CH-9: Δδ_C = 103,7 (2) - 98,2 (1) = 5,5 ppm] demonstrando a redução de densidade eletrônica como consequência da significativa atenuação do efeito mesomérico do átomo de oxigênio sustentado pelo carbono C-6 após a acetilação. Tais modificações confirmaram que a monoacetilação envolveu somente a hidroxila localizada neste átomo de carbono (C-6).

Assim, o policetídeo rubrofusarina 1 isolado de Senna macranthera var. nervosa (Vogel) Irwin & Barnebyem e seu derivado monoacetilado foram caracterizados como 5,6-diidroxi-8-metoxi-2-metilbenzo[g]cromen-4-ona (1) e 5-O-acetil-6-diidroxi-8-metoxi-2-metilbenzo[g]cromen-4-ona (2), respectivamente.

Teste de inibição da enzima DNA Topo II-α

A presença do cromóforo de estrutura plana, em decorrência dos dois anéis aromáticos condensados, confere ao composto rubrofusarin (1) a possibilidade de interação com a enzima Topo II-α. Devido a esta característica estrutural avaliou-se a possível ação de 1 sobre a DNA Topo II-α humana, no ensaio de relaxação do DNA super-helicoidizado (kDNA) (Chen & Liu, 1994; Esteves-Souza et al., 2006). A Figura 2 mostra o resultado do ensaio de relaxação do kDNA, indicando que 1 apresentou total inibição da Topo II-α em concentraηão de 120 µM, ao se observar na linha 1, a ausência da banda do kDNA relaxado; na concentração de 60 µM evidenciou-se inibição parcial, já que as bandas do kDNA relaxado e super-helicoidizado são observadas (linha 2), enquanto que na concentração de 30 µM não houve inibição (linha 3). Este resultado foi comparado com a etoposida, um inibidor bem conhecido e específico da Topo II-α, que foi usado como controle positivo (100 µM) apresentando perfil similar ao observado com a rubrofusarina (Figura 3). A Tabela 2 sumariza os resultados obtidos.

Rufrofusarina (1) apresentou atividade inibitória frente a DNA-Topo II-α humana, mostrando ser um bom protótipo para futuras investigações em direção a novos anti-virais e anti-tumorais.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ, Rio de Janeiro), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Fundação Universitária José Bonifácio (FUJB, UFRJ, Rio de Janeiro) e a PRONEX (4002) pelo apoio financeiro. Os autores também agradecem à botânica Márcia Campos, do Jardim Botânico do Rio do Rio de Janeiro, pela identificação da planta.

Recebido 23 Fevereiro 2008

Aceito 17 Setembro 2008

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  09 Mar 2009
• Data do Fascículo
  Dez 2008

Histórico

• Recebido
  23 Fev 2008
• Aceito
  17 Set 2008