Glycosyl flavonoids from Croton campestris St. Hill. (Euphorbiaceae)

rbfar Revista Brasileira de Farmacognosia Rev. bras. farmacogn. 0102-695X 1981-528X Sociedade Brasileira de Farmacognosia Curitiba, PR, Brazil Four flavonoids were isolated from the butanolic extract of the aerial parts of Croton campestris St. Hill. (Euphorbiaceae). These compounds were identified as 3-O-b-D-apiofuranosyl-(1®2)-galactopyranoside quercetin (1), 3-O-b-D-galactopyranoside quercetin (hyperin) (2), 3-O-a-L-arabinopyranoside quercetin (guaijaverin) (3) and 3-O-a-L-ramnopyranoside quercetin (quercitrin) (4). They have been isolated for the first time from Croton campestris. Their structures were elucidated by UV, MS and NMR experiments including ¹H-¹H (2D NOESY, 2D COSY), ¹H-13C (2D HETCOR), 13C (APT) and by comparison of the spectral data with those reported in the literature. ARTIGO Flavonóides O-glicosilados de Croton campestris St. Hill. (Euphorbiaceae) Glycosyl flavonoids from Croton campestris St. Hill. (Euphorbiaceae) Paula M.L. dos SantosI, *; Jan SchripsemaII; Ricardo M. KusterI INúcleo de Pesquisas de Produtos Naturais, Bloco H, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Ilha do Fundão, 21949-900, Rio de Janeiro, RJ, Brasil IILaboratório de Ciências Químicas, Centro de Ciência e Tecnologia, Universidade Estadual do Norte Fluminense, 28015-620, Campos dos Goytacazes, RJ, Brasil RESUMO Do extrato butanólico de Croton campestris St. Hill. (Euphorbiaceae) foram isolados quatro flavonóides, todos O-glicosídeos da quercetina. Estas substâncias foram identificadas como 3-O-b-D-apiofuranosil-(1®2)-galactopiranosil quercetina (1), 3-O-b-D-galactopiranosil quercetina (hiperina) (2), 3-O-a-L-arabinopiranosil quercetina (guaijaverina) (3) e 3-O-a-L-ramnopiranosil quercetina (quercitrina) (4).O presente trabalho relata a presença destas substâncias pela primeira vez para esta espécie de Croton, cuja elucidação estrutural deu-se por espectroscopia em UV, EM e RMN, incluindo as técnicas bidimensionais: 1H-1H (2D NOESY, 2D COSY), 1H-13C (2D HETCOR) e 13C (APT), além de comparações com os dados da literatura. Unitermos: Croton campestris, Euphorbiaceae, flavonóides O-glicosilados, quercetina. ABSTRACT Four flavonoids were isolated from the butanolic extract of the aerial parts of Croton campestris St. Hill. (Euphorbiaceae). These compounds were identified as 3-O-b-D-apiofuranosyl-(1®2)-galactopyranoside quercetin (1), 3-O-b-D-galactopyranoside quercetin (hyperin) (2), 3-O-a-L-arabinopyranoside quercetin (guaijaverin) (3) and 3-O-a-L-ramnopyranoside quercetin (quercitrin) (4). They have been isolated for the first time from Croton campestris. Their structures were elucidated by UV, MS and NMR experiments including 1H-1H (2D NOESY, 2D COSY), 1H-13C (2D HETCOR), 13C (APT) and by comparison of the spectral data with those reported in the literature. Keywords:Croton campestris, Euphorbiaceae, flavonoids, quercetin glycosides. INTRODUÇÃO A família Euforbiácea possui cerca de 317 gêneros e 7500 espécies. O gênero Croton, que possui 700 espécies, é largamente distribuído em regiões quentes da Terra, menos freqüentemente em regiões temperadas e raramente em regiões frias (Heluani et al., 2000). A espécie Croton campestris, popularmente conhecida como velame-do-campo, é um arbusto de 1-2 metros de altura originário do Brasil, ocorrendo principalmente nas regiões sudeste e nordeste (Corrêa, 1975), possuindo largo emprego popular como poderoso depurativo, usado no combate à escrofulose, doenças venéreas, impingens, tumores, moléstias de pele, reumatismo, úlcera do útero, diarréia e artritismo (Cruz, 1982). O gênero Croton é uma fonte rica em diterpenos, principalmente os do tipo clerodano (Puebla et al., 2002). Das raízes desta espécie foram isolados anteriormente três diterpenos: velamolona, velamona e acetato de velamolona (Babili et al., 1998). Entretanto, alguns trabalhos relatam a presença de flavonóides em algumas espécies do gênero como em Croton zambezicus onde cinco flavonóides C-glicosilados foram isolados (Wagner et al., 1970), dois derivados de quercetina eterificados isolados de Croton schiedeanus (Guerrero et al., 2002) e tilirosideo de Croton gnaphalii (Lencina et al., 2001). Este artigo descreve a identificação de quatro flavonóides O-glicosilados encontrados em Croton campestris, todos descritos pele primeira vez para esta espécie vegetal. MATERIAL E MÉTODOS Procedimentos experimentais gerais Os espectros de RMN foram obtidos em espectrômetro JEOL Eclipse a 400 MHz (1H) e 100 MHz (13C), sendo as amostras solubilizadas em DMSO-d6. Os espectros de massas foram obtidos por inserção direta em aparelho CLAE/EM Micromass ZMD pela técnica electrospray ionization-ESI. As cromatografias em camada delgada (CCD) foram feitas em cromatofolhas de gel de sílica 60F254 (Merck), utilizando-se como reagentes cromogênicos o NP (diphenylboric acid 2-aminoethyl ester) da Spectrum e PEG (poliethylenoglycol) da Vetec. A cromatografia em coluna de média pressão (CLMP) foi feita em coluna SR 10/50 utilizando-se como fase estacionária a resina Toyopearl HW-40C. A cromatografia líquida de alta eficiência (CALAE) foi feita em aparelho Shimadzu CBN 10 A com bomba LC-10 e detector Diodearray SPD-M10A, coluna Lichrospher 100 RP-18 (5m) - Merck. Material vegetal As partes aéreas de Croton campestris (1 Kg) foram fornecidas pela empresa Flora Medicinal J. Monteiro da Silva Ltda, cuja identificação foi realizada pelo Dr. Ricardo Lainetti do Laboratório de Farmacobotânica, Faculdade de Farmácia, UFRJ, RJ. O referencial da espécie encontra-se depositado no Herbário do Jardim Botânico do Rio de Janeiro (nº 208978). Extração, purificação e identificação das substâncias O material já seco e moído (1 Kg), foi macerado em metanol por uma semana. O filtrado foi concentrado à pressão reduzida obtendo-se 22,7 g do extrato bruto (EB). O EB foi submetido à partição em hexano, diclorometano, acetato de etila e água em funil de separação. O fracionamento foi direcionado para o isolamento de flavonóides glicosilados, portanto, as frações em acetato de etila e em água foram submetidas à CCD analítica em gel de sílica e reveladas com uma solução de aminoetilfenilborato a 1% em etanol (NP) e polietilenoglicol a 5% em etanol (PEG) para a detecção de flavonóides. A fração aquosa apresentou grande concentração de flavonóides e foi novamente particionada em butanol. A fração butanólica foi analisada por CCD de gel de sílica onde foi detectada a presença de flavonóides. O solvente foi evaporado à pressão reduzida, obtendo-se 4,12 g de extrato. O concentrado foi dissolvido em metanol:água (3:7) e filtrado. O filtrado foi concentrado à pressão reduzida, resultando em 3,15 g de extrato que foi aplicado em coluna de média pressão (CLMP), utilizando-se como fase móvel MeOH:H2O (3:7), MeOH:H2O (1:1), MeOH:H2O (7:3) e MeOH puro. As 87 frações recolhidas da coluna foram cromatografadas em CCD de gel de sílica para serem reunidas por semelhança, utilizando-se como eluente o sistema AcOEt:AcOH:HCOOH:H2O (100:11:11:27) para a eluição de 1-25 e AcOEt:MeOH:H2O (8:1,5:0,5) de 26 em diante. Das frações 30-31 isolou-se a substância 1 (33,4 mg), de 44-48 a substância 2 (87,7 mg) e de 54-55 a mistura de 3 e 4 (25 mg). As substâncias isoladas assim como as frações acetato de etila e butanólica, foram analisadas por CLAE acoplada a detector de UV em soluções de 1 mg/mL preparadas antes da análise. Os dados cromatográficos foram obtidos em aparelho Shimadzu CBN 10 A com bomba LC-10 AD a um fluxo de 1 mL/min em coluna Lichrosper 100 RP-18 (5mm) Merck. A análise cromatográfica deu-se em gradiente decrescente de polaridade na seguinte programação: ácido trifluoroacético 0,05% em água (solvente A) e acetonitrila (solvente B): 1-10 min, 10% B linear; 10-40 min 70% B linear. Os dados de UV foram obtidos pelo detector Diodearray SPD-M10A. Para a determinação do peso molecular das substâncias utilizou-se a técnica electrospray ionization (EM-ESI), adequada para substâncias não-voláteis (Crews et al., 1988). Por tratar-se de polifenóis, a obtenção do íon molecular deu-se sob condições de íon negativo (M-H)-. Dados espectroscópicos das substâncias 3-O-b-D-Apiofuranosil-(1®2)-galactopiranosil quercetina (1). Pó amarelo. UV lmax 354, 259. RMN1H (400 MHz, DMSO-d6) d (ppm) (ver Tabela 2). RMN13C (100 MHz, DMSO-d6) d (ppm) (ver Tabela 1). EM m/z (%): [M-H]- 595 (100). 3-O-b-D-Galactopiranosíl quercetina (hiperina) (2). Pó amarelo. UV lmax/nm 354, 259. RMN1H (400 MHz, DMSO-d6) d (ppm) (ver Tabela 2). RMN13C (100 MHz, DMSO-d6) (ppm) (ver Tabela 1). EM m/z (%): [M-H]- 463 (100). 3-O-a-L-Arabinopiranosíl quercetina (guaijaverina) (3). Pó amarelo. UV lmax/nm 354, 256. RMN1H (400 MHz, DMSO-D6) d (ppm) (ver Tabela 2). RMN13C (100 MHz, DMSO-d6) (ppm) (ver Tabela 1). EM m/z (%): 300 (96), 301 (92), [M-H]- 433 (29). 3-O-a-L-Ramnopiranosíl quercetina (quercitrina) (4). Pó amarelo. UV lmax/nm 348, 259. RMN1H (400 MHz, DMSO-d6) d (ppm) (ver Tabela 2). RMN13C (100 MHz, DMSO-d6) (ppm) (ver Tabela 1). EM m/z (%): 300 (96), 301 (92), [M-H]- 447 (100). RESULTADOS As substâncias 1-4 (Figura 1) foram identificadas pela análise dos espectros de UV, EM e RMN (incluindo as técnicas APT, COSY, HETCOR e NOESY) e em comparação com os dados da literatura como 3-O-b-D-apiofuranosil-(1®2)-galactopiranosil quercetina (1) (Hamburger e Hostettmann, 1985; Takahashi et al., 2001), 3-O-b-D-galactopiranosil quecetina (hyperina) (2) (Yasukawa e Takido, 1987), 3-O-a-L-arabinopiranosil quercetina (guaijaverina) (3) (Webby e Markhan, 1994; Fraisse et al., 2000) e 3-O-a-L-ramnopiranosil quercetina (quercitrina) (4) (Markhan et al., 1978; Mendez et al., 1995). DISCUSSÃO O espectro de UV de cada uma das substâncias mostrou-se característico para flavonóis, apresentando dois máximos de absorção, um entre 256-259 nm relativo ao anel A e outro entre 348-354 nm relativo ao anel B, onde este último, pela substituição em C-3 (na quercetina a absorção é de 370 nm), sofre efeito hipsocrômco (Zuanazzi, 2000). Dos espectros de massas de 1 e 2 obteve-se os íons a m/z 595 (100%) e m/z 463 (100%) respectivamente, fornecendo um peso molecular de 596 u para a substância 1 e 464 u para a substância 2. Do espectro de massas da mistura 3 e 4 obteve-se os íons a m/z 433 (29%) e 447 (100%) respectivamente, fornecendo um peso molecular de 434 u para a substância 3 e 478 u para a substância 4. O espectro de 3 e 4 apresentou duas fragmentações, m/z 300 (96%) e m/z 301 (92%), que podem ser atribuídas a fragmentações da ligação acetal entre a quercetina (m/z 301) e o açúcar. Através dos dados de RMN foi possível definir a configuração dos H anoméricos, onde, para a substância 1, H-H vicinal J1"-2" = 7,6 Hz, indicou a configuração b para o carbono anomérico C-1" (Wald et al., 1986), como é comum aos flavonóides ligados a glicose e galactose (Markhan et al., 1978). Através da técnica NOESY foi possível correlacionar as interações entre os hidrogênios espacialmente próximos (Figura 2), definindo a seqüência da ligação entre os açúcares e a aglicona. A ligação entre a quercetina e a galactose foi observada pela interação de H-6' da aglicona com os hidrogênios H-1'' e H-2'' da galactose, além da interação de H-2' com H-2''. A ligação da galactose na posição 2'' com a apiose na posição 1''', foi evidenciada pela interação entre H-1''', H-2'' e H-1''. As correlações C-H foram obtidas pela técnica HETCOR onde foi possível confirmar a região dos hidrogênios dos açúcares entre d 5,6 e d 3,3. Para a substância 2, J = 7,5 Hz indicou a configuração b para o carbono anomérico C-1'' (Yasukawa e Takido, 1987), para a ligação a seria em torno de 3 Hz (Rocha, 1995). O espectro de HETCOR mostrou a região dos hidrogênios dos açúcares entre d 5,4 e d 3,2 através da correlação com os respectivos carbonos. A análise do espectro da mistura de 3 e 4 foi possível com o uso da técnica NOESY onde diferenciou-se o H-5' da arabinose em 3 do H-5' da ramnose em 4. Para a substância 3, a constante de acoplamento J = 5,1 Hz e d 5,26 para H-1'', indicou a configuração para o carbono anomérico C-1'' (Mendez et al., Rocha, 1995; Fraisse et al., 2000), para a ligação b teria J = 3,4 Hz e d em torno de 3,98 (Bergeron et al., 1998). O espectro de HETCOR mostrou a região dos hidrogênios dos açúcares entre d 5,3 e d 3,2 através da correlação com os respectivos carbonos. Os dados da literatura para C-3'' (d 70,8) e C-5'' (d 64) (Markhan et al., 1978; Rocha, 1995), indicam a forma piranosídica para a arabinose. Por último, a substância 4, apresentou J = 1,4 Hz para H-1'' e d 5,28 em DMSO-d6, que também foi obtida em metanol-d3d 5,37, correspondendo à configuração para o carbono anomérico (Azen e Horowitz, 1977; Mendez et al., 1995; Rocha, 1995). O espectro de NOESY contribuiu para estabelecer a correlação entre os hidrogênios aromáticos H-6' e H-5' da aglicona e entre os hidrogênios H-6'' e H-4'' da ramnose. AGRADECIMENTOS À CAPES pela bolsa de P.M.L.S., à Drª Ana Cláudia Amaral (FIOCRUZ) pelos espectros de massas e ao Prof. Dr. José Paz Parente (NPPN/UFRJ) pelas valiosas sugestões. Recebido em 25/02/05 Aceito em 18/10/05 * E-mail: [e-mail], Tel. + 55-21-25626791, Fax + 55-21-22702683 Asen S, Horowitz RM 1977. 2''-O-acetylquercitrin from azalea flowers. Phytochemistry 16: 147-148. 2''-O-acetylquercitrin from azalea flowers Phytochemistry 1977 147 148 16 Asen S Horowitz RM Babili FE, Moulis C, Bom M, Respaud MJ, Fourasté I 1998. Three furano diterpenes from the bark of Croton campestris. Phytochemistry 48: 165-169. Three furano diterpenes from the bark of Croton campestris Phytochemistry 1998 165 169 48 Babili FE Moulis C Bom M Respaud MJ Fourasté I Bergeron C, Martson A, Antus S, Gauthier R, Hostettmann K 1998. 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