Resumo de Tese
Tipagem molecular do sistema sangüíneo Duffy em indivíduos expostos à malária na Amazônia brasileira
Molecular genotyping of Duffy blood group among individuals exposed to malaria in brazilian Amazon
Carlos E. Cavasini
Orientador:
Marcelo U. Ferreira
Resumo
O sistema sangüíneo Duffy é constituído pelos alelos FY1, FY1null, FY2, FY2ES e FY2WK que produzem os fenótipos FY:1,-2 , FY:-1,2 , FY:1,2 , FY:-1,2WK e FY:-1,-2. A ausência da proteína Duffy nos eritrócitos, que corresponde ao fenótipo FY:-1,-2 ou Duffy negativo, é predominante nos africanos, que possuem o alelo FY2ES . Este alelo apresenta uma mutação na região promotora do gene, abolindo a expressão da proteína apenas nas hemácias. O FY2 é fracamente expresso nos eritrócitos FY:-1,2WK. Indivíduos Duffy negativos são resistentes à malária por P. vivax; sugerindo-se que FY foi alvo de seleção natural pelo parasita. Informações sobre polimorfismo eritrocitário são escassas nos Brasil.
Compara-se neste trabalho a distribuição de genótipos do sistema sangüíneo Duffy em 68 pacientes com infecção por Plasmodium vivax e em 59 controles com malária não-vivax de Rondônia, Brasil. Amostras de sangue foram colhidas dos pacientes que procuravam tratamento para malária. A extração do DNA de leucócitos humanos foi realizada com o método de fenol-clorofórmio. A confirmação e identificação das espécies de Plasmodium foram feitas pela reação em cadeia da polimerase (PCR), utilizando-se primers espécie-específicos em duas reações seqüenciais. A tipagem molecular do sistema sangüíneo Duffy foi realizada através de PCR com uma combinação de primers alelos-específicos para quatro reações diferentes. Para a diferenciação entre aos alelos FY2 e FYWK, usou-se um protocolo de amplificação com primers Fy3 e Fy4, seguido de digestão com enzima de restrição AciI.
Alguns produtos de PCR foram clonados e os plasmídeos recombinantes foram seqüenciados. Para a comparação entre proporções utilizou-se o teste de c2, com nível de significância de 5%. A amplificação específica do DNA de Plasmodium dos 97 pacientes examinados, resultou em 63% de P. falciparum, 59% de P. vivax e 9% de P. malariae. A freqüência dos alelos FY1, FY2 e FYES foi, respectivamente, de 0,404, 0,426 e 0,169 nos pacientes com malária vivax e, nos pacientes com malária não-vivax, foi de 0,398, 0,398 e 0,203. Nenhum paciente infectado com P. vivax, mas 12% dos controles não-vivax, eram homozigotos para o alelo FYES, que abole a expressão do antígeno Duffy em hemácias. No entanto, não se observou evidência de proteção significativa contra P. vivax entre indivíduos heterozigotos para FY. Todos os alelos FY2 seqüenciados eram do tipo selvagem. O alelo FYWK, que tem sido recentemente associado com a expressão eritrocitária muito fraca do antígeno Duffy, não foi encontrado entre pacientes locais com infecção por P. vivax.
Abstract
Duffy blood group (FY) polymorphisms are important in endemic areas of the malaria parasite Plasmodium vivax, due to its role as an erythrocyte receptor for this species but not for the other human malaria parasites. The absence of FY on the red blood cells of individuals from many African ethnic groups and their descendants causes no obvious ill effect, and confers natural resistance against P. vivax infection. Here we compared the Duffy blood group genotype distribution, as determined by polymerase chain reaction (PCR) with allele-specific primers, in 68 Plasmodium vivax-infected patients and 59 non-vivax malaria carriers from Rondônia, Brazil. Venous blood was collected, after informed consent, from 127 patients with microscopically confirmed malaria diagnosis.
Human DNA was isolated using standard phenol-chloroform extraction and ethanol precipitation protocols. On-site Plasmodium species identification was made by standard thick smear microscopy, and further confirmed by species-specific PCR in 97 (76%) patients or by reexamination of available blood smears in 30 (24%) patients. Amplification of the alleles coding for FY was performed with combinations of the forward oligonucleotide primers GATAFY2 (that targets the mutated GATA-1 promoter sequence) and FYAB2 (that targets the wild-type promoter sequence), and the forward primers FYAREV (that targets the FY1 allele) and FYBREV2 (that targets the FY2 allele). The following allele frequencies were found: (a) P. vivax-infected patients, FY1 = 0.404, FY2 = 0.426 and FYES = 0.169, (b) patients infected with either P. falciparum and/or P. malariae, FY1 = 0.398, FY2 = 0.398 and FYES = 0.203. Homozygosity for the allele FY, which abolishes the Duffy antigen expression on erythrocytes, was observed in 12% non-vivax controls but in no P. vivax patient. However, no significant association was found between FY heterozygosity and protection against P. vivax. The FYWK allele, which has recently been associated with very weak erythrocyte expression of Duffy antigen, was not found in local P. vivax patients. Since a few equivocal results were obtained with restriction fragment length polymorphism analysis, these findings were confirmed by sequencing a 661-bp region of the Duffy gene from six P. vivax-infected subjects presenting the FY2FYES genotype, as well as one patient with the FY2FY2 genotype and one with the FY1FY2 genotype. Four clones for patients were sequenced, in order to have both alleles represented. A single patient, presenting the genotype FY2FY2, was heterozygous for the G298A mutation in exon 2; no instances of C265T mutation, which characterizes the FYWK allele, or any other mutation, were found.
Recebido: 06/06/01
Aceito: 30/07/01
Tese de Mestrado em Ciências da Saúde. Eixo Temático: Medicina e Ciências Correlatas. Curso de Pós-Graduação da Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto FAMERP, SP
Datas de Publicação
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Publicação nesta coleção
15 Jul 2003 -
Data do Fascículo
Ago 2001
