Efeito dos óleos essenciais sobre a antracnose in vitro e em frutos de mamoeiro

Effect of essential oils on in vitro anthracnose and in fruits of the papaya plant.

RESUMO

As doenças pós-colheita do mamão são as principais responsáveis pelas perdas que ocorrem durante esse processo. A antracnose é uma doença causada pelo fungo Colletotrichum gloeosporioides. Esse patógeno tem a capacidade de se estabelecer no fruto imaturo, permanecendo em estado latente até que as condições se tornem favoráveis ao seu desenvolvimento. O presente estudo teve como objetivo determinar o efeito fungistático dos óleos essenciais sobre o fungo C.gloeosporioides. Os experimentos foram realizados no laboratório de Fitossanidade da Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul, Unidade Universitária de Cassilândia, foram três etapas, quais sejam: I efeito dos óleos essenciais sobre a germinação de conídios, II- ação in vitro dos óleos sobre micélios fúngicos e III- efeito dos óleos essenciais sobre o fungo em frutos do mamoeiro. Para as três fases o delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado, em esquema fatorial 6 X 5, (óleos essenciais de alecrim, menta, capim-limão, anis, árvore-chá e canela) e cinco concentrações (0 μL, 10 μL, 30 μL, 50 μL, 100 μL), com 5 repetições. A germinação de conídios foi afetada drasticamente pelos óleos de menta e árvore-chá. O efeito fungitóxico do óleo de menta foi confirmado nos experimentos subsequentes, nos quais essa substância na concentração de 100 µL inibiu completamente o crescimento micelial invivo e in vitro do fungo C. gloeosporioides. Os óleos de alecrim e árvore-chá também afetam o crescimento micelial in vivo e in vitro desse fungo, embora em menor intensidade.

Palavras-chave controle alternativo; fruticultura; doenças pós-colheita

ABSTRACT

Post-harvest papaya diseases are primarily responsible for the losses suffered during this process. Anthracnose is a disease caused by the Colletotrichum gloeosporioides fungus. This pathogen has the ability to settle in the immature fruit, remaining dormant until conditions become favorable for its development. The purpose of this study was to determine the fungicidal effect of essential oils on the C. gloeosporioides fungus. The experiments were undertaken in the Plant Health laboratory of the State University of Mato Grosso do Sul, at the University Unit of Cassilandia, where an evaluation was performed in three stages, namely: I) the effect of essential oils on spore germination, II) the in vitro action of oils on mycelium fungi, and III) the effect of essential oils on the fungus in papaya fruit. For the three phases, the experimental design was completely randomized in a 6 x 5 factorial arrangement (essential oils of rosemary, mint, lemongrass, anise, tea tree, and cinnamon) and five concentrations (0 uL, 10 uL, 30 uL, 50 uL, 100 uL) with five replications. The spore germination was drastically affected by the mint and tea tree oils. The fungitoxic effect of peppermint oil was confirmed in subsequent experiments in which this substance at a concentration of 100 uL completely inhibited the mycelial in vivo and in vitro growth of the C. gloeosporioides fungus. The rosemary and tea tree oils also affect the mycelial in vivo and in vitro growth of this fungus, albeit to a lesser degree.

Keywords alternative control; fruticulture; post-harvest diseases

INTRODUÇÃO

A crescente demanda, pelos consumidores, por produtos de boa aparência e qualidade, aliada ao menor uso de agrotóxicos, tem exigido grande atenção por parte dos produtores, com relação aos cuidados fitossanitários nas fases de produção e pós-colheita dos frutos, que limitam a sua inserção no mercado pela perda da sua qualidade (Cerdeño, 2006).

Os fungos são os principais responsáveis pelo surgimento de doenças que resultam nas perdas observadas no período pós-colheita (Ventura & Costa, 2003). O controle desses patógenos é realizado com o uso de fungicidas, que resultam em frutos com resíduos nocivos à saúde, tornando a população vulnerável às infecções e até mesmo ao desenvolvimento de doenças (Rozwalka, 2003).

Nehmi et al. (2002) o mamoeiro (Carica papaya L.) é uma das fruteiras mais cultivadas nos países de clima tropical, o Brasil é o maior produtor e exportador mundial, com uma produção de 1,7 milhões de toneladas/ano, que corresponde a 35,4% do volume mundial.

A antracnose é a principal doença pós-colheita a afetar o mamoeiro. Essa doença é causada pelo fungo Colletotrichum gloeosporioides, que tem a capacidade de se estabelecer no fruto imaturo e permanecer em estado latente, sem o aparecimento de sintomas, até que haja condições para que o processo de infecção ocorra (Nery-silva et al., 2007)

Visando à segurança alimentar e à proteção ambiental, pela extinção e/ou substituição do uso de produtos químicos por produtos alternativos, diversas pesquisas têm sido realizadas com extratos vegetais com o intuito de comprovar a eficácia dessas substâncias no controle de fitopatógenos causadores de doenças de pós-colheita no mamoeiro (Guiraldo et al., 2004).

Dentre as principais substâncias alternativas usadas no controle fitossanitário de doenças podem-se destacar os óleos essenciais, cujas propriedades antimicrobianas já são significativamente reconhecidas (Oliveira et al., 2006).

O presente trabalho teve como objetivo determinar o potencial antimicrobiano de diferentes óleos essenciais sobre o fungo C.gloeosporioides causador da antracnose em mamoeiro.

MATERIAL E MÉTODOS

Os experimentos foram conduzidos no período de janeiro a julho de 2014 no laboratório de Fitossanidade da Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul, Unidade Universitária de Cassilândia. Foram usados os óleos essenciais de anis (Pimpinella anisum), capim-limão (Cymbopogon citratus), alecrim (Rosmarinus officinalis), canela (Cinnamomum zeylanicum), árvore-chá (Melaleuca alternifolia) e menta (Mentha piperita), adquiridos de forma comercial, provenientes da Farmácia de Ervas Ribeirão Preto – SP.

Ensaio I: Efeito fungitóxico dos óleos essenciais em conídios

A atividade antifúngica dos óleos essenciais em diferentes concentrações sobre a germinação de conídios foi determinada mediante à análise microscópica dessas estruturas desenvolvidas em meio de cultura B.D.A. acrescido de óleos essenciais em diferentes concentrações. A suspensão aquosa de conídios foi preparada por meio da adição e filtragem de micélios fúngicos de C. gloeosporioides, utilizando-se água esterilizada deionizada e gaze. A concentração de esporos dessa suspensão foi determinada com auxílio de hemocitômetro, ajustada para a 2x10⁶ conídios/ml. Os óleos essenciais foram adicionados ao meio de cultura B.D.A. com o auxílio de uma micropipeta de volume variável. Essas substâncias foram adicionadas ao meio B.D.A., após a autoclavagem desse meio e enquanto ainda se encontravam em estado fundente. Usou-se um agitador magnético com aquecimento para homogeneizar os óleos essenciais ao meio de cultura, sendo em seguida vertidos em placas de Petri com o diâmetro de 90 mm. As amostras de 5000 μL da suspensão conidial foram depositadas sobre as placas de petri vertidas, sendo incubadas em B.O.D. à 25ºC ± 2ºC, com fotoperíodo de 12 horas. A avaliação foi realizada determinando-se a porcentagem de germinação de 100 conídios, 14 horas após o início da incubação, contando-se o número de esporos germinados e não germinados ao microscópio óptico em três diferentes pontos da placa de Petri, no aumento de 40x (Silva & Bastos, 2007). Foram considerados como esporos germinados aqueles que apresentaram tubo germinativo, que apresentarem tamanho igual ou superior aos conídios.

Ensaio II: Atividade antimicrobiana in vitro

A atividade antimicrobiana in vitro dos óleos essenciais sobre C. gloesporioides foi determinada por meio do crescimento micelial do fungo em meio de cultura acrescido das referidas substâncias em diferentes concentrações. Os óleos essenciais em diferentes concentrações foram adicionados ao meio de cultura ainda fundente, sendo usado um agitador magnético com aquecimento para homogeneizar a solução, sendo essa mistura vertida em placas de Petri com 90 mm de diâmetro (Leme et al., 2007). Cada tratamento recebeu um disco de 5 mm de diâmetro contendo micélio e esporos de C. gloeosporioides provenientes da colônia pura com idade de 7 dias, mantidos em B.O.D. por oito dias a temperatura de 25ºC ± 2º C, com fotoperíodo de 12 horas luz.

A avaliação foi realizada 96 horas após a inoculação do fungo através de medições do diâmetro das colônias (média de duas medidas diametralmente opostas) (Leite et al., 2009).

Ensaio III: Avaliação do controle alternativo

Os frutos de mamoeiro cultivar Golden foram adquiridos nos supermercados de Cassilândia - MS. Esses frutos foram selecionados e foram utilizados frutos que apresentavam mais de 50% com a coloração amarela da casca, onde a uma condição fisiológica do fruto para o desenvolvimento das hifas do fungo (Gomes, 2008), passaram por um processo de assepsia, foram lavados com detergente neutro e submetidos a um tratamento hidrotérmico, sendo mantidos a 49º C por 20 minutos e em seguida resfriados a 8º C por 20 minutos e embalados em sacos plásticos (Akamine & Arisumi, 1953).

Nos testes com os frutos foram realizados os mesmos tratamentos apresentados nos experimentos I e II. Realizada a assepsia, a parte da superfície dos frutos, com cerca de 10 mm de diâmetro foi levemente escoriada com o auxílio de bisturi, sendo então aplicadas as substâncias dos tratamentos utilizando uma micropipeta, permanecendo por 24h em ambiente asséptico para a secagem completa do material. Paralelo aos testes estabeleceu um grupo controle no qual os frutos receberam apenas água deionizada. Após esse período, os frutos, receberam um disco de B.D.A. de 5 mm de diâmetro com micélio fúngico. Esses discos foram retirados da cultura pura com idade de 7 dias. Em seguida, os frutos foram recobertos com sacos plásticos e incubados em B.O.D., a 25ºC ± 2ºC.

A avaliação foi realizada através de medições do diâmetro da lesão in vivo (média de duas medidas diametralmente opostas), 96 horas após a inoculação nos frutos (Leite et al., 2009).

Análise Estática dos ensaios I, II e III

O delineamento experimental utilizado foi o Delineamento Inteiramente Casualizado, em esquema fatorial 6x5, (óleos essenciais de alecrim, menta, capim-limão, anis, árvore-chá, canela) e cinco concentrações (0 μL, 10 μL, 30 μL, 50 μL, 100 μL), com 5 repetições. As médias foram comparadas pelo teste de Tukey (P<0,05), utilizando o software Sisvar (Ferreira, 2011).

RESULTADOS

Efeito fungitóxico dos óleos essenciais na germinação de conídios

Os resultados mostram que houve diferença estatística, entre os tratamentos na inibição na germinação dos conídios de C. gloeosporioides, embora a eficiência inibitória tenha oscilado em relação às concentrações, a taxa de germinação dos conídios decresceu com o aumento das concentrações testadas, diferindo significativamente do controle.

Os óleos essenciais com a concentração de 10 µL de capim-limão e anis inibiram 38,6% e 39,4%, apresentaram os maiores efeitos negativos sobre a germinação. Os óleos essenciais de capim-limão 28,4% e alecrim 31,2% apresentaram os maiores efeitos sobre a germinação na concentração de 30 µL. O óleo essencial de árvore-chá com 14,0%, sobre a germinação na concentração de 50 µL,O óleo essencial de menta com 9,4% apresentou o maior efeito sobre os conídios na concentração de 100 µL entre todos os tratamentos.

Atividade antimicrobiana in vitro

Os valores do crescimento micelial no período de 96 horas, entre os tratamentos, o óleo essencial (10 µL), de capim-limão 25,8 mm, teve o maior efeito fungitóxico.

Os óleos essenciais (30 µL), capim-limão 25,8 mm, canela 27,0 mm e anis 31,2 mm os maiores efeitos fungitóxicos. Os óleos essenciais (50 µL) de árvore-chá 18,67 mm, alecrim 23,2 mm e capim-limão 25,0 mm apresentaram efeitos fungitóxicos. O óleo essencial de menta (100 µL) inibiu o crescimento micelial. por completo (0,0 mm).

TABELA 1
Germinação in vitro de conídios de Colletotrichum gloeosporioides submetidos a diferentes óleos essenciais em diferentes concentrações em %.

	Germinação (%)
Doses		Alecrim		Menta		Capim- Limão		Anis		Árvore- Chá		Canela
F(Trat) =		350,28**
C.V. (%) =		4,04
0 µL		55,8 aD		55,8 aE		55,8 aC		55,8 aC		55,8 aD		55,8 aB
10 µL		42,4 bC		46,2 cD		38,6 aB		39,4 aB		47,6 cC		53,2 dB
30 µL		31,2 abB		43,0 cC		28,4 aA		31,4 bA		44,4 cB		48,4 dA
50 µL		25,6 bA		38,6 dB		28,2 bcA		31,0 cA		14,0 aA		48,0 eA
100 µL		24,4 cA		9,4 aA		28,0 dA		31,0 eA		13,6 bA		48,0 fA

• Letras iguais minúscula na linha e maiscula na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade*, Teste F significativo ao nível de 5%**, C.V. Coeficiente de Variação.

A variação do crescimento micelial para as diferentes concentrações de 0, 10, 30, 50 e 100 µL dos óleos essenciais, o alecrim, menta, anis, árvore-chá e canela com o aumento da concentração a uma diminuição no crescimento micelial do fungo diferindo significativamente comparado com o controle. O óleo essencial de capim-limão nas concentrações de 10 a 100 µL não diferiram entre si, apresentaram efeito fungistático, diferindo do controle.

Avaliação do controle da antracnose in vivo.

Após a inoculação, no período de 96 horas, comparando o efeito dos tratamentos sobre o tamanho da lesão na dose 10 µL, observa-se que o óleo essencial de capim-limão 25,8 mm teve o maior efeito fungitóxico no desenvolvimento das lesões.

Os melhores efeitos fungitóxicos foram os óleos essenciais (30 µL), de capim-limão 25,0 mm, canela 27,0 mm e anis 31,2 mm.

Os óleos essenciais (50 µL) de árvore-chá 18,6 mm, alecrim 23,2 mm e capim-limão 25,0 mm, obtiveram os menores desenvolvimentos fúngicos.

A concentração avaliada de 100 µL, o óleo essencial de menta inibiu o crescimento micelial por completo (0,00 mm) apresentando uma característica fungicida.

O desenvolvimento das lesões para as diferentes concentrações de 0, 10, 30, 50 e 100 µL dos óleos essenciais, o alecrim, menta, anis, árvore-chá e canela com o aumento da concentração a uma diminuição das lesões diferindo significativamente do controle. O óleo essencial de capim-limão nas concentrações de 10 a 100 µL apresentaram efeito fungistático, diferindo do controle

TABELA 2
Crescimento micelial in vitro do fungo Colletotrichum gloeosporioides expostos a diferentes concentrações óleos essenciais

Doses	Diâmetro médio após 96h da inoculação (mm)
	Tratamentos
		Alecrim		Menta		Capim-limão		Anis		Árvore- Chá		Canela
0 µL		77,0 aD*		77,0 aD		77,0 aB		77,0 aC		77,0 aC		77,0 aC
10 µL		44,4 cC		67,2 eC		25,8 aA		33,0 bB		53,7 dB		33,4 bB
30 µL		34,3 bB		62,0 dBC		25,0 aA		31,2 abB		48,2 cB		27,0 aAB
50 µL		23,2 abA		59,1 dB		25,0 abcA		31,2 cB		18,6 aA		27,0 bcAB
100 µL		16,6 bcA		0,0 aA		25,0 dA		23,3 cdA		14,7 bA		25,9 dA
F(Trat) =		67,03**
CV (%)=		9,19

• Letras iguais minúscula na linha e maiscula na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade*, Teste F significativo ao nível de 5%**, C.V. Coeficiente de Variação.

TABELA 3
Desenvolvimento da lesão in vivo do fungo Colletotrichum gloeosporioides expostos a diferentes concentrações de óleos essenciais

Doses	Diâmetro médio das lesões após 96h da inoculação (mm)
	Tratamentos
			Alecrim		Menta		Capim- Limão		Anis		Árvore- Chá		Canela
0 µL			77,00 aD		77,00 aD		77,00 aB		77,00 aC		77,00 aC		77,00 aC
10 µL			44,40 cC		67,20 eC		25,80 aA		33,00 bB		53,75 dB		33,40 bB
30 µL			34,30 bB		59,15 dBC		25,00 aA		31,20 abB		48,20 cB		27,00 aAB
50 µL			23,20 abA		62,02 dB		25,00 abcA		31,20 cB		18,67 aA		27,00 bcAB
100 µL			16,67 bcA		0,00 aA		25,00 dA		23,38 cdA		14,75 bA		25,98 dA
F(Trat) =		67,03**
CV (%)=		9,19

• Letras iguais minúscula na linha e maiscula na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade*, Teste F significativo ao nível de 5%**, C.V. Coeficiente de Variação.

DISCUSSÃO

A uma relação dose-dependente nos casos em que ocorre a inibição gradativa do fitopatógeno com o aumento das concentrações testadas (Machado et al., 2013).

Os resultados obtidos, para o óleo essencial de alecrim, foram similares aos encontrados por Soylu et al. (2010), em estudos realizados com óleo essencial de alecrim, no controle do fungo Botritis cinerea. Sousa Junior et al. (2009) obtiveram a inibição completa do crescimento micelial dos fungos Aspergillus niger, A. flavus e Fusarium sp. quando submetidos ao óleo essencial de alecrim na concentração de 25 µL em condições laboratoriais.

Os óleos essenciais de capim-limão e canela apresentaram baixa eficiência no controle germinativo de conídios do fungo C. gloeporioides enquanto que os de alecrim e de menta se mostraram mais eficientes. Dados similares foram encontrados por Carnelossi et al. (2009) avaliando o óleo essencial de menta in vitro. Esses resultados contrariam os resultados obtidos por Lorenzetti et al. (2011) que determinou o efeito de diferentes óleos essenciais, dentre eles o capim-limão, canela, alecrim e menta sobre a germinação de conídios do fungo Botritis cinerea, relatando que os dois primeiros foram mais eficientes, chegando a inibir a germinação de isolados resistentes. Lorenzetti et al. (2012) ainda determinou o efeito do óleo essencial de menta, sobre a germinação de esporos do fungo Puccinia nakanishikii, obtendo resultados satisfatórios.

A elevada eficiência do óleo essencial de capim-limão também foi relatada por Santos et al. (2010) ao determinarem a fungitoxicidade in vitro dos óleos essenciais de capim-limão (Cymbopogon citratus), citronela (Cymbopogon nardus), em concentrações que variaram de 250 a 1250 ppm sobre o fungo Helminthosporium sp.

Embora os resultados obtidos para o capim-limão neste estudo sejam pouco satisfatórios, dentre os fatores que poderiam explicar a baixa eficiência desse óleo nesta pesquisa, pode-se citar a sua elevada capacidade volátil, o que contribui para eventuais perdas nas suas propriedades fungitóxicas.

Quando comparado aos melhores resultados obtidos neste estudo, pode-se dizer que o óleo essencial de árvore-chá apresentou uma eficiência mediana. No entanto, resultados similares a este foram relatados em outros estudos. Pereira et al. (2011) ao utilizarem o óleo essencial de árvore-chá no controle de Alternaria solani em tomateiro, observaram que essa substância inibiu parcialmente o crescimento micelial do fungo quando usadas em doses superiores a 750 μL.

O óleo essencial de canela apresentou baixo efeito sobre a germinação de conídios, in vitro e in vivo. Um dos fatores que poderia explicar a baixa eficiência apresentada pelo óleo essencial de canela neste trabalho seria a dosagem adotada. Jham et al. (2005) determinaram o efeito fungicida do óleo essencial de canela sobre os fungos Aspergillus flavus e A. niger, obtendo a inibição completa de crescimento a partir dos valores de 300 µL.

Os óleos essenciais possuem baixo risco ao ambiente, produtores e consumidores, além de não favorecerem o desenvolvimento de resistência do patógeno (Derbalah et al., 2012).

Os óleos essenciais de árvore-chá, menta, anis, alecrim e árvore-chá apresentam efeito fungitóxico e fungistático podendo ser utilizados no controle da antracnose.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem o apoio financeiro da Capes e Fundect.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  2016

Histórico

• Recebido
  22 Maio 2015
• Aceito
  23 Fev 2016