Atividade antibacteriana de extratos de erva mate (Ilex paraguariensis A.St.-Hil.)

Antibacterial activity of yerba mate (Ilex paraguariensis A.St.-Hil.) extracts

Atividade antibacteriana de extratos de erva mate (Ilex paraguariensis A.St.-Hil.)

Antibacterial activity of yerba mate (Ilex paraguariensis A.St.-Hil.) extracts

Girolometto, G.^I; Avancini, C.A.M.^I; Carvalho, H.H.C.^II; Wiest, J.M.I, II, ^*

^IUniversidade Federal do Rio Grande do Sul - UFRGS, Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias

^IIInstituto de Ciência e Tecnologia de Alimentos ICTA/UFRGS

RESUMO

Através de testes de diluição, em sistema de tubos múltiplos, determinou-se a intensidade de atividade de inibição bacteriana (IINIB) e intensidade de atividade de inativação bacteriana (IINAB) de extratos hídricos (decocto), etanólicos (alcoolatura e hidroalcoolatura) de cambitos e de folhas de Ilex paraguariensis A.St.-Hil.(Aquifoliaceae) sobre as bactérias Staphylococcus aureus (ATCC 25.923), Enterococcus faecalis (ATCC 19.433), Salmonella enteritidis (ATCC 11.076) e Escherichia coli (ATCC 11.229). Todas as formas de extração apresentaram capacidade de inativação e/ou inibição seletivas sobre as bactérias avaliadas, porém os extratos originados por destilação etanólica apresentaram os melhores resultados. Salmonella enteritidis demonstrou maior sensibilidade, seguida por Enterococcus faecalis. Posteriormente, estes dois agentes foram submetidos a testes de suspensão, no mesmo sistema, na presença e ausência de matéria orgânica (soro bovino), sob controle do fator tempo. A presença de matéria orgânica diminuiu, enquanto o tempo de exposição aumentou a sensibilidade de Salmonella enteritidis e de Enterococus faecalis aos diferentes extratos de Ilex testados.

Palavras chave:Ilex paraguariensis, atividade antibacteriana, plantas medicinais, erva mate

ABSTRACT

Dilution tests in multiple tube system were employed to evaluate the intensity of bacterial inhibition activity (IINIB) and bacterial inactivation activity (IINAB) of aqueous extracts (decoctions) and ethanolic extracts (alcoholic and hydroalcoholic extracts) from "cambitos" of Ilex paraguariensis St. Hil. (Aquifoliaceae) leaf on the bacteria Staphylococcus aureus (ATCC 25.923), Enterococcus faecalis (ATCC 19.433), Salmonella enteritidis (ATCC 11.076), and Escherichia coli (ATCC 11.229). All extraction procedures presented selective inactivation and/or inhibition capacity on the evaluated bacteria; however, extracts from ethanolic distillation yielded the best results. Salmonella enteritidis had the highest sensitivity, followed by Enterococus faecalis. Later, such agents were subjected to suspension tests, in the same system, in absence or presence of organic matter (bovine serum), under controlled time. Salmonella enteritidis and Enterococus faecalis sensitivity to the different tested Ilex extracts decreased in the presence of organic matter and increased with exposure time.

Key words:Ilex paraguariensis, antibacterial activity, medicinal plants, yerba mate

INTRODUÇÃO

O gênero botânico Ilex pertence à família Aquifoliaceae, que é cosmopolita e compreende cerca de 500 espécies, sendo a maior parte de origem asiática (Alikaridis, 1987).

Ilex paraguariensis A.St.-Hill recebe popularmente vários nomes como mate, erva-mate, erveira, congonha e outros, sendo uma planta que tem distribuição desde o estado de Mato Grosso do Sul, passando por São Paulo até Rio Grande do Sul, com mais freqüência na mata dos pinhais dos três estados sulinos do Brasil (Lorenzi, 2000).

A distribuição natural da erva mate no continente sul-americano abrange aproximadamente 540.000 Km², compreendendo o território do Brasil, Argentina e Paraguai, situados entre as latitudes de 21º e 30º S e longitudes de 48º30^' W e 56º10^' W, com altitudes variáveis entre 500 e 1000 metros (Pasinato, 2003).

O grande interesse comercial por Ilex paraguariensis, além de seus aspectos culturais e gastronômicos, se deve à presença de bases xânticas: cafeína e teobromina, princípios farmacológicos estimulantes cardio-circulatórios que também são encontrados em outras espécies vegetais como no café, no cacau e no guaraná, segundo Rico et al. (1995). A planta ainda apresenta em sua constituição química vitaminas, aminoácidos e saponinas triterpênicas, de interesse nutricional (Rates, 2004).

A pesquisa da atividade antimicrobiana em plantas com indicativo medicinal, condimentar ou alimentar, dentro do princípio da triagem com droga crua, vem merecendo ênfase,tais como os trabalhos desenvolvidos por: Lemos et al. (2000) pesquisando especificamente a atividade bactericida de macela (Achyrocline satureoides); Avancini (2002) avaliando 36 plantas com indicativo etnográfico medicinal da Mata Atlântica residual em Porto Alegre, com ênfase à escadinha ou sinapismo (Hypericum caprifoliatum); Carvalho et al. (2005) envolvendo bacteriostasia e bactericidia de 32 plantas com indicativo condimentar; Sousa & Wiest (2007) pesquisando especificamente bacteriostasia e bactericidia de garupá (Aloysia gratissima); Santos et al. (2007) investigando a atividade antimicrobiana do latéx da mangabeira (Hancomia speciosa). Carvalho et al. (2006), além de avaliar a atividade antibacteriana do extrato aquoso de estragão (Artemisia dracunculus var. inodora), demonstraram a influência da bacteriostasia / inibição bacteriana deste extrato, na preditividade diagnóstica dos resultados negativos de uma técnica oficial de isolamento de Salmonella sp.

Kubo et al. (1993) comprovaram a atividade antimicrobiana de Ilex paraguariensis frente a bactérias e fungos patogênicos. Dentre as bactérias que sofreram inibição total encontram-se Bacillus subtilis, Brevibacterrium ammoniagenes, Propionibacterium acnes, Staphylococcus aureus e Streptococcus mutans

A poda da erva-mate gera uma quantidade de resíduos muito significativos, representada pelos galhos que não são aproveitados na indústria, os denominados cambitos, que permanecem abandonados na lavoura, oportunizando riscos ocupacionais por acidentes perfuro-cortantes durante as colheitas subseqüentes. O objetivo deste trabalho foi avaliar in vitro a atividade de inibição e de inativação bacterianas de diferentes extratos de Ilex paraguariensis, buscando fundamentar a agregação de valor e de renda a resíduos de sua cadeia produtiva como potenciais insumos anti-sépticos ou desinfetantes aplicáveis em questões de saúde e produção em sistemas de agricultura familiar.

MATERIAL E MÉTODO

A amostra de Ilex paraguariensis estudada, constituiu-se de uma mistura de folhas e de cambitos ou galhos de diferentes exemplares cultivados em propriedade ervateira familiar convencional no Município de Ilópolis / RS (28º 55^' 28.24^'' S - 52º 07^' 56.20^'' O), localizado a 195 Km de Porto Alegre, a 730m acima do nível do mar, no Vale do Taquari, região Central do Rio Grande do Sul. A coleta foi intermediada pela Entidade de Organização e Assistência Social São Brás (EMOBRAS), sediada no município e efetivou-se em novembro de 2004. A planta foi caracterizada e identificada botanicamente, a partir de exsicatas, segundo Ming (1996), pelo Prof. Rinaldo Pires dos Santos, do Departamento de Botânica da UFRGS, sendo estas posteriormente encaminhadas para registro e depósito junto ao Herbário do Instituto de Biociências/Departamento de Botânica da UFRGS, Porto Alegre/RS, Brasil, recebendo o número de registro 142.448.

Os diferentes extratos da planta foram obtidos a partir de folhas e de cambitos segundo Farmacopéia (1959), constituindo-se de decoctos (cambitos secos e folhas secas na proporção de 100 g de planta para 1000 mL de água destilada estéril, em aquecedor de refluxo com reconstituição do volume evaporado), de hidroalcoolaturas (100 g de cambitos secos em 1000 mL de etanol à 70ºGL) e de alcoolaturas (400 g de folhas verdes em 1000 mL de etanol à 96ºGL). Estes extratos etanólicos foram submetidos à destilação à vácuo, por aparelho rota-vapor, sob pressão reduzida, para extração total da fase alcoólica, com posterior reconstituição com água destilada estéril. Fez-se controle de esterilidade de todos os extratos estudados, retirando-se alíquota de 5 mL, semeada em tubos de Caldo BHI (Brain Hearth Infusion, OXOID), incubados à 37ºC, por até 48 horas, confirmando-se os resultados por plaqueamento em Ágar-Nutriente (Nutrient Agar, OXOID).

Nas confrontações com os extratos vegetais, foram utilizados isolados bacterianos padrões de Staphylococcus aureus (ATCC 25.923), Enterococcus faecalis (ATCC 19.433), Salmonella enteritidis (ATCC 11.076) e Escherichia coli (ATCC 11.299), mantidas em bacterioteca e reativadas em infusão de cérebro e coração (BHI, OXOID) à 37ºC, por 18 a 24 horas de incubação aeróbia, atingindo no mínimo 1,0 x 10⁸ UFC mL^-1, através de diluições seriais logarítmicas, constituindo concentrações bacterianas controladas.

A avaliação da atividade antibacteriana dos extratos vegetais, expressa em IINIB (intensidade de inativação bacteriana/bacteriostasia) e em IINAB (intensidade de inativação bacteriana/bactericidia) realizou-se pelo teste de diluição (DVG, 1981) modificado por Avancini (1995; 2002), através da técnica de tubos múltiplos, acrescidos ou não dos desinibidores bacterianos, quais sejam, Tween 80 à 2% e por lecitina à 1%, segundo Andrade & Macedo (1996). Estes desinibidores foram complementados por histidina à 0,1%, segundo Reybrouck (1979, 1998), sendo acrescidos ao BHI antes do extrato vegetal e do inóculo bacteriano . Após 72 horas de confrontação aeróbia, à 37ºC no sistema, verificou-se a presença ou ausência de bactérias viáveis nestes diferentes substratos, pela transferência de alíquotas, através de alça bacteriológica calibrada (0,05 mL), de todos os tubos múltiplos com e sem desinibidores, a placas de Petri com ágar nutriente (NA, ACUMEDIA) avaliando-se este crescimento 24 horas após nova incubação aeróbia, à 37ºC.

Em um segundo momento, aplicou-se o teste de suspensão simples, bem como o teste de suspensão com matéria Orgânica, esta representada por soro sangüineo bovino, inativado e esterilizado (DVG, 1981; Avancini, 1995; Avancini, 2002), confrontando Salmonella enteritidis (ATCC 11.076) e Enterococcus faecalis (ATCC 19.433) com os extratos de origem etanólica de folhas verdes e de cambitos secos, quais sejam, os inóculos bacterianos e as categorias de extratos que se destacaram dentre os Testes de Diluição preliminares.

Os resultados foram representados por variáveis ordinais arbitrárias, que assumiram valores de oito (8) a zero (0), indicando as diferentes intensidades da atividade antibacteriana, tanto para IINIB (inibições) e IINAB (inativações), sendo o valor 8 indicativo de atividade antibacteriana máxima e o valor zero indicativo de ausência de atividade antibacteriana.

A avaliação dos resultados obtidos fez-se através de análise de variância (ANOVA) e comparação das médias pelo Teste de Tukey.

RESULTADO E DISCUSSÃO

A Tabela 1 evidencia os resultados do confronto das quatro bactérias com o extrato de cambitos secos, demonstra que Salmonella enteritidis foi o agente mais sensível à este extrato observando-se inibição (valor arbitrário máximo 8) e inativação (valor 6,67), seguido por Enterococcus faecalis (inibição 5,33 embora apresentando inativação valor zero). Estas duas bactérias apresentaram diferença significativa entre si, bem como em relação ao Staphylococcus e Escherichia (p< 0,05). Estas duas últimas bactérias, por sua vez, apresentaram-se menos sensíveis ao extrato, não diferindo significativamente entre si (p > 0,05). Especificamente às quatro bactérias testadas frente a este extrato, constataram-se diferenças significativas (p< 0,05) quanto à presença e ausência dos desinibidores bacterianos em todas elas.

A Tabela 2, relativa ao confronto das quatro bactérias com o extrato de folhas verdes de Ilex, demonstrou total sensibilidade de Salmonella enteritidis (valor arbitrário 8) ao extrato em estudo, tanto na presença como na ausência de desinibidores. Estes resultados apresentaram diferença significativa (p<0,05) em relação ao Enterococcus faecalis, enquanto Staphylococcus aureus e Escherichia coli apresentaram-se menos sensíveis ao extrato, não diferindo significativamente entre si (r>0,05). Enterococcus faecalis apresentou diferença significativa (r<0,05) entre valores de inativação e de inibição, detectada pela presença dos desinibidores, caracterizando a relevância destes na preditividade da determinação de eficácia in vitro de antibacterianos. Valores coincidentes de inibição (IINIB) e inativação (IINAB) do extrato de folhas verdes de Ilex sobre Salmonella enteritidis (valor 8), indicando não só inibição máxima como inativação máxima, possuem preditividade assegurada pela presença/ausência dos desinibidores nos testes.

As Tabelas 3 e 4, apresentadas a seguir, demonstram a baixa sensibilidade das diferentes bactérias testadas, confrontadas com os decoctos de cambitos secos, bem como de folhas secas de erva mate.

A análise da Tabela 5 demonstrou diferença significativa (p<0,01) entre os três métodos utilizados para a extração dos princípios ativos, quais sejam: por alcoolatura, por hidroalcoolatura e por decoctos. Independente da bactéria testada, a forma de extração que apresentou melhor ação antibacteriana foi a alcoolatura de folhas verdes, apresentando diferença significativa (p<0,05) quando comparada com hidroalcoolatura de cambitos secos, bem como com os decoctos de folhas verdes e de cambitos secos, estes últimos sem diferença significativa entre suas atuações.

Esta diferença quanto à atividade antibacteriana entre as diferentes formas de extração pode fundamentar-se na hipótese da presença de compostos fitoquímicos voláteis na erva-mate, perdidos durante a decocção, os quais, possivelmente, sejam responsáveis pela atividade antibacteriana demonstrada em relação aos extratos etanólicos, provavelmente mais estáveis.

Uma vez confirmado que os extratos alcoólicos de folhas verdes e hidroalcoólicos de cambitos secos apresentaram os melhores resultados frente à Salmonella enteritidis e Enterococcus faecalis, confrontaram-se, novamente, estas bactérias com estes extratos, através do teste de suspensão, em sistema de tubos múltiplos, com presença e ausência de 20% de matéria orgânica (soro bovino inativado, estéril), observando-se, todavia, diferentes tempos de confrontação no teste.

Na Tabela 6 pode-se avaliar que os diferentes tempos de exposição da bactéria Enterococcus faecalis frente aos extratos apresentaram diferença significativa (r < 0,01), assinalando que o aumento do tempo de exposição deixa a bactéria mais sensível. Nota-se também a diferença significativa entre os tempos de exposição 5 e 15 minutos e os tempos 30 e 60 minutos (p < 0,05). A análise de variância confirmou também, a diferença significativa da diminuição da sensibilidade em relação a presença de matéria orgânica (soro bovinos) nos extratos (r = 0,99), sugerindo a diminuição da eficácia do extrato. Em relação a Salmonella enteritidis, quanto aos diferentes tempos de exposição, através da análise de variância, é possível demonstrar uma diferença significativa entre eles (r < 0,01). O teste de Tukey subseqüente demonstrou não haver diferença entre os tempos 30 e 60 minutos (p > 0,05), mas que há diferença entre as atuações de 15 minutos e de 5 minutos (p < 0,05).

Especificamente em relação à atividade antibacteriana de erva mate, os resultados aqui apresentados confirmam aqueles de Kubo et al. (1993) especificamente em relação ao Staphylococcus aureus. Quanto ao Streptococcus mutans, embora não testado neste trabalho, este possui características biológicas bastante semelhantes ao Enterococcus faecalis, ex- Streptococcus faecalis. Santos et al. (2007), embora valendo-se da técnica de difusão em discos para a triagem de atividade antibacteriana em extratos vegetais, utilizaram os mesmos padrões internacionais de Streptococcus sp.

A técnica de tubos múltiplos, pelos testes de diluição e de suspensão, conforme já assinalaram Avancini (2002), Carvalho et al. (2005; 2006), bem como Souza & Wiest (2007), demonstraram ser satisfatória para a avaliação dos diferentes extratos, permitindo quantificar concentrações e tipos de ação (bacteriostasia/inibição e bactericidia/inativação) dos inóculos, fundamentando também a avaliação da preditividade dos resultados positivos e negativos observados. A técnica permitiu, outrossim, à nível de triagem in vitro, no princípio de estudo com droga crua de Ilex paraguariensis, indicar Salmonella Enteritidis como o agente bacteriano mais sensível dentre os testados, a alcoolatura (etanol absoluto sobre planta verde) como a forma de extração mais eficaz e as folhas como parte da planta que apresentou melhor controle in vitro sobre as bactérias confrontadas. Os resultados permitem concluir, outrossim, que os resíduos na cadeia produtiva da erva mate, representados por folhas e cambitos, apresentam potencial como insumos antissépticos ou desinfetantes, aplicáveis na atenção básica à saúde e à produção em sistemas de agricultura familiar ou de pequeno porte, com ênfase à prevenção e ao controle específico de salmonelose, uma vez atendidos os aspectos de demanda tecnológica mínima e da sustentabilidade destas ações e cuidados básicos em saúde.

AGRADECIMENTO

A Eleutério Orsolin, Virginio Chiesa e Maria Baldissera, pelo acesso e fornecimento do material de pesquisa. Ao CNPq, pelo apoio financeiro.

Recebido para publicação em 06/12/2007

Aceito para publicação em 22/04/2008

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  16 Mar 2012
• Data do Fascículo
  2009

Histórico

• Recebido
  06 Dez 2007
• Aceito
  22 Abr 2008