Immunoperoxidase technique in experimental chronic chagasic myocarditis

rimtsp Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo Rev. Inst. Med. trop. S. Paulo 1678-9946 Instituto de Medicina Tropical São Paulo, SP, Brazil La enfermedad de Chagas ha sido considerada como una de las causas más frecuentes de miocarditis crônica. Siendo descriptas Ias alteraciones inmunológicas, como patogenia para este tipo de enfermedad. Por tal motivo, se empleó la técnica de inmunoperoxidasa para la detección de depósitos de inmunoglobulinas en la miocardiopatía chagásica crônica experimental. Se utilizaron 41 ratones Swiss de 3 meses de vida, los mismos fueron inoculados intraperitonealmente con dosis entre 10 y 10(5); tripomastigotas de la cepa Tulahuen. La reinoculación se realizo 1 mes después con dosis entre 10² y 10(5); siendo sacrificados a los 6 (n=21) y 9 meses (n=9) de la primera inoculación, prévios estúdios elect roçar diográficos. Posteriormente se estudiaron los miocardios y músculos esqueléticos con técnicas histológicas de rutina, inmunoperoxidasa (método peroxidasa anti-peroxidasa) e inmunofluorescencia (directa e indirecta). Los métodos más sensibles para la detección de la enfermedad de Chagas crônica resultaron ser los estúdios histológicos (73%) y la electrocar-diografia (83%) a los 6 meses pi.y (89%) a los 9 meses p.i. (pos-infección). Se observaron diferentes alteraciones miocárdicas, desde infiltrados linfocitarios leves y focales en intersticio hasta reemplazo de miocitos por tejido conectivo. Los miocardio auriculares (21/23,91%) fueron más afectados que los ventrículos (9/23, 39%); mientras que las típicos quistes chagásicos resultaron excepcionales Los músculos esqueléticos (11/18 Y 7/9) presentaron distintos grados de lesión histológica, desdes leves a extensos infiltrados linfoplasmocitarios con presencia de fibras necróticas. Mientras que con la técnioa de inmunoperoxidasa, los antígenos se revelaron como depósitos granulares intracitoplasmáticos difusamente distribuidos, tanto para IgG como para Ig totales. La coincidência entre este método y Ias lesiones musculares histológicas fueron 11/18 (61%) a los 6 meses p.i.y 6/8 (75%) a los 9 meses p.i. Por otra parte, los depósitos de lg totales en corazón se observaron dispuestos difusamente, en forma finamente granular dentro de los miocitos ventriculares La coincidência entre ambas técnicas (inmunoperoxidasa e histología) resultó ser dei 36% y 66% para los animales sacrificados a los 6 y 9 meses p.i. respectivamente. Este fenômeno inmunológico se incremento notablemente con el curso crônico de la enfermedad. Con respecto a la sensibilidad, tanto la inmunoperoxidasa como la inmunofluorescencia directa fueron altamente sensibles en músculo esquelético (100%, p 0,01). Por otra parte, la técnica de inmunofluorescencia directa en corazón, evidencio pobres resultados, mientras que el método peroxidasa anti-peroxidasa incrementó su sensibilidad de 21,4% a los 6 meses pi. al 66.6% a los 9 meses p.i. (p 0.001). Este modelo experimental, en el cual se observan reacciones inmunológicas reveladas por la técnica de inmunoperoxidasa, podría resultar de utilidad, considerando la necesidad de obtener una vacuna adecuada para prevenir la miocardiopatía chagásica. ORIGINAL ARTICLES Immunoperoxidase technique in experimental chronic chagasic myocarditis Técnica de inmunoperoxidasa en miocardiopatia chagásica crônica experimental Maria Celina Morales, M.d.I; José Milei, M.D.II IResearch Fellow, National Academy of Medicine IIChief, Pathology Section. Hospital Institute of Cardiology. Assistant Professor of Internal Medicine, University of Buenos Aires Address for reprints SUMMARY Chagas'disease has been described as the commonest form of chronic myocarditis. An immunologic pathogenesis has been discribed for this form of the disease. So far, no immunoperoxidase technique has been used for the detection of immunological deposits in chronic experimental Chagas'myocardiopathy. Forty-one Swiss mice, three months old were inoculated intraperitoneally with doses between 10 and 105 Tulahuen trypomastigotes. Mice were reinoculated one month after with doses between 102 and 105 and sacrificed at 6 (n=21) and 9 months (n=9) after the first inoculation. ECGs were recorded before sacrifice. Immunoperoxidase technique (peroxidase-antiperoxidase method), immunofluorescence (direct and indirect) as well as histological studies were performed in myocardiums and skeletal muscles of the surviving animals. The most sensitive methods for detecting chronic chagasic infection were the routine histologic studies (73%) and the ECGs 83% and 89% on 6 and 9 mo. post-infected mice, respectively. Myocardial involvement varied from interstitial mild focal lymphocyte infiltrates up to replacement of myocytes by loose connective tissue. Atrial myocardiums (21/23, 91%) were more affected than ventricles (9/23, 39%). Typical chagasic nests were rarely found. Skeletal muscle involvement (11/18 and 7/9) varied from mild to extensive lymphocyte and plasmacell infiltrates, and necrotic fibers. The involved antigen were shown in skeletal muscles by the immunoperoxidase technique as diffusely arranged granular intracytoplasmatic deposit for both IgC and total immunoglobulins. The coincidence between this technique and histologic muscle lesions was 11/18 (61(%) in 6 mo. and 6/8 (75%) at 9 mo. post-infection. In heart, delicate granular deposits of total immunoglobulins were seen diffusely arranged within the ventricular myocytes; coincidence between immunoperoxidase technique anl histologic involvement increased from 36 to 66% in animals sacrifeced 6 and 9 mo. post-infection. This strongly stressed the increase of immunologic phenomena with the chronification of infection. Concerning sensitivity, immunoperoxidase and direct immunofluorescence were highly sensitive in skeletal muscle (100%, p < 0.01). Conversely, direct immunofluorescence technique showed poor results in heart while immunoperoxidase increased its sensitivity from 21.4% (at 6 mo.) to 66.6% (at 9 mo.) post-infection (p < 0.001). Considering the necessity of obtaining an adequate vaccine in order to prevent this disease an experimental model like this, rendering immunological reactions as revealed by the immunoperoxidase technique, would be useful. Key words: Chagas' disease; Immunoperoxidase technique; Chronic myocarditis RESUMEN La enfermedad de Chagas ha sido considerada como una de las causas más frecuentes de miocarditis crônica. Siendo descriptas Ias alteraciones inmunológicas, como patogenia para este tipo de enfermedad. Por tal motivo, se empleó la técnica de inmunoperoxidasa para la detección de depósitos de inmunoglobulinas en la miocardiopatía chagásica crônica experimental. Se utilizaron 41 ratones Swiss de 3 meses de vida, los mismos fueron inoculados intraperitonealmente con dosis entre 10 y 105; tripomastigotas de la cepa Tulahuen. La reinoculación se realizo 1 mes después con dosis entre 102 y 105; siendo sacrificados a los 6 (n=21) y 9 meses (n=9) de la primera inoculación, prévios estúdios elect roçar diográficos. Posteriormente se estudiaron los miocardios y músculos esqueléticos con técnicas histológicas de rutina, inmunoperoxidasa (método peroxidasa anti-peroxidasa) e inmunofluorescencia (directa e indirecta). Los métodos más sensibles para la detección de la enfermedad de Chagas crônica resultaron ser los estúdios histológicos (73%) y la electrocar-diografia (83%) a los 6 meses pi.y (89%) a los 9 meses p.i. (pos-infección). Se observaron diferentes alteraciones miocárdicas, desde infiltrados linfocitarios leves y focales en intersticio hasta reemplazo de miocitos por tejido conectivo. Los miocardio auriculares (21/23,91%) fueron más afectados que los ventrículos (9/23, 39%); mientras que las típicos quistes chagásicos resultaron excepcionales Los músculos esqueléticos (11/18 Y 7/9) presentaron distintos grados de lesión histológica, desdes leves a extensos infiltrados linfoplasmocitarios con presencia de fibras necróticas. Mientras que con la técnioa de inmunoperoxidasa, los antígenos se revelaron como depósitos granulares intracitoplasmáticos difusamente distribuidos, tanto para IgG como para Ig totales. La coincidência entre este método y Ias lesiones musculares histológicas fueron 11/18 (61%) a los 6 meses p.i.y 6/8 (75%) a los 9 meses p.i. Por otra parte, los depósitos de lg totales en corazón se observaron dispuestos difusamente, en forma finamente granular dentro de los miocitos ventriculares La coincidência entre ambas técnicas (inmunoperoxidasa e histología) resultó ser dei 36% y 66% para los animales sacrificados a los 6 y 9 meses p.i. respectivamente. Este fenômeno inmunológico se incremento notablemente con el curso crônico de la enfermedad. Con respecto a la sensibilidad, tanto la inmunoperoxidasa como la inmunofluorescencia directa fueron altamente sensibles en músculo esquelético (100%, p 0,01). Por otra parte, la técnica de inmunofluorescencia directa en corazón, evidencio pobres resultados, mientras que el método peroxidasa anti-peroxidasa incrementó su sensibilidad de 21,4% a los 6 meses pi. al 66.6% a los 9 meses p.i. (p 0.001). Este modelo experimental, en el cual se observan reacciones inmunológicas reveladas por la técnica de inmunoperoxidasa, podría resultar de utilidad, considerando la necesidad de obtener una vacuna adecuada para prevenir la miocardiopatía chagásica. Texto completo disponível apenas em PDF. Full text available only in PDF format. ACKNOWLEDGEMENTS Authors are indebted to Dr. P.M. Cossio and: his team for the fulfilment of immunofluorescent technique and to Dr. A. Molinolo for skilful assistance and advise in the attainment of immunoperoxidase technique. The authors also gratefully acknowledge the technical assistance of Noemi Borasit and the secretarial cooperation of Ana Becú. Address for reprints: Dra. María Celina Morales. Hospital Instituto de Cardiología. Coronel Díaz 2423. 1425 Buenos Aires - Argentina. Recebido para publicação em 25/7/1985. 1. ARRAES-HERMANS, M. A. & TEXEIRA, M. L. - Anti-actin anti-myosin specificity of human antibodies in chronic and acute Chagas disease. In: CONGRESSO INTERNACIONAL SOBRE DOENÇA DE CHAGAS, Rio de Janeiro, 1979. Anais. Rio de Janeiro, Ind. Gráf. Cruzeiro do Sul, 1979. p. 195. Anais 1979 195 ARRAES-HERMANS M. A. TEXEIRA M. L. 2. ATHANAZIO, P. R.; HOFF, R. & ANDRADE, Z. À. - EVI antibodies in individuals of the State of Bahia. In: CONGRESSO INTERNATIONAL SOBRE DOENÇA DE CHAGAS, Rio de Janeiro, 1979. Anais. Rio de Janeiro, Ind. Gráf. Cruzeiro do Sul, 1979. p. 200. Anais 1979 200 ATHANAZIO P. R. HOFF R. ANDRADE Z. À. 3. BOLOMO, N.; MILEI, J.; COSSIO, P. M.; SEGURA, E.; LAGUENS, R. P.; FERNANDEZ, L. & ARANA, R. M. - Experimental Chagas disease in a South American Primate (Cebus sp). Medicina (B. Aires), 40: 667, 1980. Experimental Chagas disease in a South American Primate (Cebus sp) Medicina (B. Aires) 1980 667 40 BOLOMO N. MILEI J. COSSIO P. M. SEGURA E. LAGUENS R. P. FERNANDEZ L. ARANA R. M. 4. COSSIO, P. M.; CASANOVA, M.; DTEZ, C; BELLIDO, C; ARCE, L.; STORINO, R. A.; DE LA VEGA, M. & ARANA, R. - Autoimmune response against myocardial tissue in Chagas'disease. Medicine (B. Aires), 45: 643, 1985. Autoimmune response against myocardial tissue in Chagas'disease Medicine (B. Aires) 1985 643 45 COSSIO P. M. CASANOVA M. DTEZ C BELLIDO C ARCE L. STORINO R. A. DE LA VEGA M. ARANA R. 5. COSSIO, P. M.; DENDUCHIS, B.; CASANOVA, M. B.; PODESTÁ, M. R.; STERIN-BORDA, L.; BORDA, E.; VILA, C; ARANA, R. M. & LUSTIG, L. - Contrasting behaviour of EVI antigen in Chagas'disease with laminin: Studies on cryostat sections, cultured cells and isolated rat atrial preparation. Clin. exp. Immunol, (sent for publication, 1986). Contrasting behaviour of EVI antigen in Chagas'disease with laminin: Studies on cryostat sections, cultured cells and isolated rat atrial preparation Clin. exp. Immunol 1986 COSSIO P. M. DENDUCHIS B. CASANOVA M. B. PODESTÁ M. R. STERIN-BORDA L. BORDA E. VILA C ARANA R. M. LUSTIG L. 6. COSSIO, P. M.; LAGUENS, R. P.; DIEZ, C; SZARFMAN, A.; SEGAL, A. & ARANA, R. M. - Chagasic cardiopathy: antibodies reacting with plasma membrane of striated muscle and endothelial cells. Circulation, 50: 1252, 1974. Chagasic cardiopathy: antibodies reacting with plasma membrane of striated muscle and endothelial cells Circulation 1974 1252 50 COSSIO P. M. LAGUENS R. P. DIEZ C SZARFMAN A. SEGAL A. ARANA R. M. 7. COSSIO, P. M.; DIEZ, C; SZARFMAN, A.; KREUTZER, E.; CANDIOLO, B. & ARANA, R. M. - Chagasic car-diopathy. Demonstration of a serum gamma-globulin factor which reacts with endocardium and vascular structures. Circulation, 49: 13, 1974. Chagasic car-diopathy: Demonstration of a serum gamma-globulin factor which reacts with endocardium and vascular structures Circulation 1974 13 49 COSSIO P. M. DIEZ C SZARFMAN A. KREUTZER E. CANDIOLO B. ARANA R. M. 8. COSSIO, P. M.; DE LA VEGA, M. T.; BASOMBRÍO, M. A.; CASANOVA, M. B.; BOLOMO, N. J.; MILEI, J.; ARANA, R. M. & ALONSO, D. - Estúdios inmunológicos y morfológicos en la enfermedad de Chagas experimental del ratón. Medicina (B. Aires), 43: 517, 1983. Estúdios inmunológicos y morfológicos en la enfermedad de Chagas experimental del ratón Medicina (B. Aires) 1983 517 43 COSSIO P. M. DE LA VEGA M. T. BASOMBRÍO M. A. CASANOVA M. B. BOLOMO N. J. MILEI J. ARANA R. M. ALONSO D. 9. COSSIO, P. M.; LAGUENS, R. P.; KREUTZER, E.; DIEZ, C; SEGAL, A. & ARANA, R. M. - Immunopathologic and morphologic studies in myocardial biopsies. Amer. J. Path., 85: 533, 1977. Immunopathologic and morphologic studies in myocardial biopsies Amer. J. Path. 1977 533 85 COSSIO P. M. LAGUENS R. P. KREUTZER E. DIEZ C SEGAL A. ARANA R. M. 10. COSSIO, P. M.; CORNEJO, L.; HERRERA, M.; VAZQUEZ, C. & ARANA, R. M. - Skeletal and heart muscle antibodies in myasthenia gravis. A new immunofluorescence pattern. Biomedicine, 19: 261, 1973. Skeletal and heart muscle antibodies in myasthenia gravis: A new immunofluorescence pattern Biomedicine 1973 261 19 COSSIO P. M. CORNEJO L. HERRERA M. VAZQUEZ C. ARANA R. M. 11. Editorial. New light on Chagas'Disease. Lancet: 1: 1150, 1965. Lancet 1965 1150 1 12. GONALEZ CAPPA, S. M.; CHIALE, P. del PRADO, G. E.; KATZIN, A. M.; MARTINI, G. W. J.; ISOLA, E. L. D. de; ABRAMO ORREGO, L. & SEGURA, N. L. -  Aislamiento de una cepa de Trypanosoma cruzi do un paciente con miocardiopatía chagásica crônica y su caracterización biológica. Medicina (B. Aires), 40: 63-68, 1980. Aislamiento de una cepa de Trypanosoma cruzi do un paciente con miocardiopatía chagásica crônica y su caracterización biológica Medicina (B. Aires) 1980 63 68 40 GONALEZ CAPPA S. M. CHIALE P. del PRADO G. E. KATZIN A. M. MARTINI G. W. J. ISOLA E. L. D. de ABRAMO ORREGO L. SEGURA N. L. 13. HATLE, L. & MELBYE, O. J. - Immunoglobulins and complement in Chronic myocardial disease. A myocardial biopsy study. Acta med. scand., 200: 385, 1976. Immunoglobulins and complement in Chronic myocardial disease: A myocardial biopsy study Acta med. scand. 1976 385 200 HATLE L. MELBYE O. J. 14. KAPLAN, M.; BOLANDE, R.; RAKITA, L. & BLAIR, J. -  Presence of bound immunoglobulins and complement in the myocardium of acute rheumatic fever. New Engl. J. Med., 271: 637, 1964. Presence of bound immunoglobulins and complement in the myocardium of acute rheumatic fever New Engl. J. Med. 1964 637 271 KAPLAN M. BOLANDE R. RAKITA L. BLAIR J. 15. KHOURY, E. & FIELDS, K. L. - Chagas'disease and autoimmunity. (Letter to the Editor). Lancet, 1: 1088, 1980. Chagas'disease and autoimmunity. (Letter to the Editor) Lancet 1980 1088 1 KHOURY E. FIELDS K. L. 16. KHOURY, E.; DIEZ, C; COSSIO, P. M. & ARANA, R. M. - Heterophil nature of EVI antibody in Trypanosoma cruzi infection. Clin. Immunol. Immunopath., 27: 283, 1983. Heterophil nature of EVI antibody in Trypanosoma cruzi infection Clin. Immunol. Immunopath. 1983 283 27 KHOURY E. DIEZ C COSSIO P. M. ARANA R. M. 17. MILEI, J. & BOLOMO, N. J. - A routine method for diagnosis of early myocardial infarction. Int. J. Cardiol., 4: 319, 1983. A routine method for diagnosis of early myocardial infarction Int. J. Cardiol. 1983 319 4 MILEI J. BOLOMO N. J. 18. MILEI, J.; MORALES, M. C; BOLOMO, N. J.; BASOMBRÍO, M. A. & COSSIO, P. M. - Correlación electrocardiográfica-anatomopatológica en la miocardio-patía chagásica crônica experimental en el ratón. Medicina (B. Aires), 44: 483, 1984. Correlación electrocardiográfica-anatomopatológica en la miocardio-patía chagásica crônica experimental en el ratón Medicina (B. Aires) 1984 483 44 MILEI J. MORALES M. C BOLOMO N. J. BASOMBRÍO M. A. COSSIO P. M. 19. MILEI, J.; BOLOMO, N. J.; VAZQUEZ, A. & NAGLE, C. - Normal and pathological electrocardiographic patterns in the Cebus Monkey. J. med. Primat., 11: 19. 1982. Normal and pathological electrocardiographic patterns in the Cebus Monkey J. med. Primat. 1982 19 11 MILEI J. BOLOMO N. J. VAZQUEZ A. NAGLE C. 20. MOLINA, H. A.; MTLEI, J. & STORINO, R. A. - Chronic Chagas 'myocardiopathy. Demonstration of "in vivo" bound immunoglobulins in heart structures by the immunoperoxidase technique. Cardiology, 71: 297, 1984. Chronic Chagas 'myocardiopathy: Demonstration of "in vivo" bound immunoglobulins in heart structures by the immunoperoxidase technique Cardiology 1984 297 71 MOLINA H. A. MTLEI J. STORINO R. A. 21. RIBEIRO DOS SANTOS, R. & HUDSON, L. - Trypanosoma cruzi: immunological consequences of parasite modification of host cells. Clin. exp. Immunol., 40: 36, 1980. Trypanosoma cruzi: immunological consequences of parasite modification of host cells Clin. exp. Immunol. 1980 36 40 RIBEIRO DOS SANTOS R. HUDSON L. 22. ROSSEN, R. D.; BUTTER, W. T.; REISBERG, M. A.; BROODS, B. K.; LEACHMAN, R. D.; MILAM, J. D.; MITTAL, K.; MOTGOMERY, J. R.; NORA, J. & RO-CHELLE, D. G. - Immunofluorescence localization of human immunoglobulins in tissues from cardiac allogeneic recipients. J. Immunol., 106: 17, 1971. Immunofluorescence localization of human immunoglobulins in tissues from cardiac allogeneic recipients J. Immunol. 1971 17 106 ROSSEN R. D. BUTTER W. T. REISBERG M. A. BROODS B. K. LEACHMAN R. D. MILAM J. D. MITTAL K. MOTGOMERY J. R. NORA J. RO-CHELLE D. G. 23. SANTOS-BUCH, C. A. & TEXEIRA, A. R. C. - The immunology of experimental Chagas'disease. III. Rejection of allogenic heart cells in vitro. J. exp. Med., 140: 38, 1974. The immunology of experimental Chagas'disease: III. Rejection of allogenic heart cells in vitro J. exp. Med. 1974 38 140 SANTOS-BUCH C. A. TEXEIRA A. R. C. 24. STERIN-BORDA, L.; COSSIO, P. M.; GIMENO, M. F.; GIMENO, A. L.; DIEZ, C; LAGUENS, R. P.; CABEZA MECKERT, P.; ARANA, R. M. - Effect of chagasic sera on the rat isolated atrial preparation: Immunological, morphological and functional aspects. Cardiovasc. Res., 10: 613, 1976. Effect of chagasic sera on the rat isolated atrial preparation: Immunological, morphological and functional aspects Cardiovasc. Res. 1976 613 10 STERIN-BORDA L. COSSIO P. M. GIMENO M. F. GIMENO A. L. DIEZ C LAGUENS R. P. CABEZA MECKERT P. ARANA R. M. 25. STERNBERGER, L. A. - Immunocytochemistry. 2nd. ed. New York, John Wiley, 1979. Immunocytochemistry 1979 STERNBERGER L. A. 26. SZARFMAN, A.; TERRANOVA, V. P.; RENNARD, S I.; FOIDART, J. M.; DE FATIMA LIMA, M.; SCHEINMAN, J. I. & MARTIN, G. R. - Antibodies to Laminin in Chagas'disease. J. exper. Med., 155: 1161, 1982. Antibodies to Laminin in Chagas'disease J. exper. Med. 1982 1161 155 SZARFMAN A. TERRANOVA V. P. RENNARD S I. FOIDART J. M. DE FATIMA LIMA M. SCHEINMAN J. I. MARTIN G. R.