O presente estudo relata a produção do soro policlonal de coelho anti-Leishmania (L.) chagasi, a padronização da técnica de imunohistoquímica (IHQ) e sua aplicação em lesões de leishmaniose cutânea (LC) diagnosticadas por isolamento de Leishmania sp. em cultura. Foram examinados 30 fragmentos de lesões ativas de LC e 10 fragmentos de lesões de etiologia fúngica, utilizados como grupo controle. A IHQ mostrou-se mais sensível na detecção de amastigotas que a coloração em hematoxilina-eosina (HE), sendo positiva em 24 fragmentos de LC (80%) e ao passo que a HE foi positiva em 16 (53%) (p = 0,028). A IHQ também marcou diferentes espécies de fungos causadoras de micoses cutâneas. Adicionalmente, verificou-se positividade no citoplasma de células mononucleares e células endoteliais. Entretanto, esse achado esteve presente no grupo controle. Conclui-se que o método de IHQ apresentou boa sensibilidade na detecção de formas amastigotas.