Detecção de Listeria, Salmonella e Klebsiella em serviço de alimentação hospitalar

Detection of Listeria, Salmonella and Klebsiella in a hospital food service

ORIGINAL ORIGINAL

Detecção de Listeria, Salmonella e Klebsiella em serviço de alimentação hospitalar

Detection of Listeria, Salmonella and Klebsiella in a hospital food service

Uelinton Manoel Pinto; Rodrigo Rezende Cardoso; Maria Cristina Dantas Vanetti¹

Departamento de Microbiologia, Universidade Federal de Viçosa. 36571-000, Viçosa, MG, Brasil

RESUMO

OBJETIVO: A presença de Listeria monocytogenes, Salmonella sp. e Klebsiella sp. em dietas enterais e em ambientes, utensílios e equipamentos de preparo de alimentos em serviço de alimentação hospitalar, foi o objetivo desta pesquisa.

MÉTODOS: A contaminação de ambientes, utensílios e equipamentos de preparo de alimentos em serviço de alimentação hospitalar por Listeria monocytogenes, Salmonella sp. e Klebsiella sp. foi avaliada em 50 amostras coletadas pela técnica de swab. Quatro amostras de dietas enterais também foram analisadas. Colônias típicas de bactérias do gênero Listeria foram isoladas de dieta enteral em ágar Oxford e a identificação da espécie L. monocytogenes foi feita por testes bioquímicos e imunológicos.

RESULTADOS: A presença de Salmonella foi detectada em dieta enteral e identificada como S. rissen por sorologia. Pela relevância como agente causador de infecções hospitalares, bactérias do gênero Klebsiella foram pesquisadas e isoladas em ágar seletivo MacConkey-inositol-carbenicilina. K. pneumoniae foi encontrada em equipamento e utensílio e K. oxytoca em ambiente, equipamento e dieta enteral. Os isolados de L. monocytogenes apresentaram resistência apenas ao antibiótico cefoxitina e os do gênero Klebsiella foram resistentes a ampicilina e amoxilina. S. rissen foi sensível aos 13 antibióticos avaliados.

CONCLUSÃO: A contaminação de 11% das amostras analisadas com pelo menos um dos patógenos, alerta para a necessidade de implantação de um rigoroso sistema de controle de qualidade nas áreas de manipulação dos alimentos, a fim de aumentar a segurança alimentar dos pacientes hospitalizados.

Termos de indexação: alimentação hospitalar; contaminação bacteriana, patógenos alimentares, susceptibilidade a antibióticos, contaminação de alimentos.

ABSTRACT

OBJECTIVE: The purpose of the research was to investigate the presence of Listeria, Salmonella and Klebsiella on samples of enteral diets and utensils, surfaces and equipments involved in food preparation in a hospital food service.

METHODS: Fifty samples collected from utensils, surfaces and equipment used for food preparation in a hospital food service, and four samples collected from enteral diets were tested for bacteria of genera Listeria, Salmonella and Klebsiella. Typical colonies of bacteria of the genus Listeria from enteral diet were isolated in Oxford agar and contamination by L. monocytogenes was confirmed by immunoanalysis.

RESULTS: L. monocytogenes, S. rissen and Klebsiella were isolated from enteral diet. For their relevance as agents of hospital infections, bacteria of the genus Klebsiella were evaluated. K. pneumoniae were found in equipment and utensil, and K. oxytoca were found in environment, equipment and enteral diet samples. L. monocytogenes showed resistance to cefoxitin and all Klebsiella were resistant to amoxacillin and ampicillin. S. rissen showed susceptibility to all 13 antibiotics tested.

CONCLUSION: The study showed that 11% of the analyzed samples were contaminated with, at least, one of the investigated pathogens. Such results reiterate the need for awareness and knowledge of effective hygienic procedures in the hospital food manipulation areas, in order to ensure patients' safety.

Index terms: food service; bacterial contamination, foodborne pathogens; antibiotic susceptibility, food contamination.

INTRODUÇÃO

Registros epidemiológicos revelam que a maioria dos surtos de doenças de origem alimentar é causada por alimentos preparados em serviços de alimentação¹. Tais surtos decorrem, principalmente, da contaminação de alimentos por bactérias como: Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, Salmonella sp., Yersinia enterocolitica, Escherichia coli e Shigella sp., dentre outras. O controle da contaminação dos alimentos por microorganismos deterioradores e patogênicos nas operações de serviços de alimentação é difícil e complexo devido à grande variedade de alimentos preparados e à necessidade da rápida utilização dos mesmos, não havendo tempo para análises. Há também o risco potencial de os manipuladores de alimentos se constituirem em portadores sadios de microorganismos patogênicos.

As infecções alimentares são particularmente importantes quando ocorrem em pacientes hospitalizados, idosos ou imunocomprometidos². Aproximadamente 50% das infecções que acometem pacientes hospitalizados são causadas por microorganismos hospitalares que colonizam o trato gastrintestinal³. Apesar disso, pouca importância é dada aos alimentos como fonte de microorganismos capazes de causar infecções hospitalares. Dietas enterais e formulados infantis devem receber atenção especial, considerando que os pacientes a quem são destinados são, geralmente, mais susceptíveis a infecções, a desidratações e suas conseqüências.

Bactérias enteropatogênicas como Salmonella sp., Shigella sp., E. coli e Campylobacter são isoladas freqüentemente em infecções ocorridas em enfermarias e pediatrias de unidades hospitalares^4,5. Constata-se que, pacientes hospitalizados ou indivíduos cujas defesas foram enfraquecidas por doenças ou terapias, estão susceptíveis às infecções causadas não só pelas bactérias reconhecidas como patogênicas de origem alimentar, como também por outros microorganismos que, geralmente, não acometem pessoas saudáveis. Entre esses patógenos oportunistas veiculados por alimentos destacam-se bactérias Gram-negativas como Enterobacter sakazakii⁶; Citrobacter freudii⁷; Pseudomonas aeruginosa⁸ e Klebsiella sp⁹. Além de serem oportunistas, alguns microorganismos envolvidos em infecções nosocomiais tornam-se resistentes às drogas antimicrobianas comumente usadas nos ambientes hospitalares. A emergência de patógenos resistentes a antibióticos é um fenômeno de preocupação na área clínica e na farmacêutica pois, segundo Meng & Doyle², sua resistência pode comprometer o tratamento de infecções alimentares severas.

Considerando que os alimentos podem constituir fonte potencial de patógenos no ambiente hospitalar, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a presença de Listeria, Salmonella e Klebsiella em um serviço de alimentação hospitalar e determinar o perfil de resistência a antibióticos das bactérias isoladas.

MATERIAIS E MÉTODOS

Cinqüenta amostras obtidas de ambientes, superfícies, utensílios e equipamentos de uma cozinha e um lactário hospitalar, foram coletadas em seis visitas diferentes, realizadas no período da manhã, após o preparo das refeições e sanitização dos equipamentos, superfícies e utensílios. As amostras foram coletadas aleatoriamente, totalizando 27 utensílios como panelas, copos, colheres, bandejas, coador, mamadeiras e potes plásticos; as amostras de superfícies incluíram três de bancadas e três de pias; as de ambientes, incluíram três amostras de ralos, quatro de torneiras e uma de azulejos. As amostras de equipamentos compreenderam três de batedeiras e seis de liqüidificadores. A técnica do swab foi empregada para a coleta de amostras. Tubos com 7cm a 10cm de comprimento foram preparados com 10mL de caldo Univer-sidade de Vermont Modificado (UVM) (Oxoid, Basingstoke, Hampshire) para isolamento de Listeria e com 10mL de água peptonada tamponada 1% para o isolamento de Salmonella e Klebsiella. Em utensílios e equipamentos, a amostragem correspondeu à área total, percorrida com swab por três vezes consecutivas. Para a amostragem de superfícies de processamento, utilizou-se o swab embebido em caldo UVM ou em água peptonada tamponada 1%, aplicado a um ângulo de 30º de contato com a superfície, percorrendo cinco áreas de 50cm², por três vezes consecutivas. Após a coleta do material, cada swab teve a parte manuseada cortada e descartada, e foi colocado no tubo apropriado contendo o meio de cultura.

Também foram coletadas em frascos plásticos, quatro amostras de dietas enterais modulares com volumes aproximados de 100mL, a seguir encaminhadas ao laboratório, sob refrigeração, para a análise microbiológica.

Isolamento e identificação das bactérias

Listeria monocytogenes

Os swabs com amostras coletadas dos utensílios e equipamentos, destinados à detecção de Listeria, foram incubados em caldo de enriquecimento primário UVM a 30ºC por 26h; após este período, uma alíquota de 1mL foi transferida para 10mL de caldo Fraser (Oxoid) para enriquecimento secundário. Após a incubação a 35ºC por 30h, as amostras foram semeadas, pelo método de estria composta, em ágar seletivo Oxford (Oxoid) por 48h a 35ºC. De cada placa de ágar Oxford com colônias suspeitas de Listeria, caracterizadas por apresentarem-se pretas, com halo escuro resultante da degradação da esculina, três colônias foram selecionadas e estriadas em ágar tripticaseína e soja-TSA (Oxoid) adicionado de 0,6% de extrato de levedura. As colônias isoladas foram mantidas em ágar semi-sólido SIM - Sulfito-indol-motilidade (Difco, Detroit, Michigan) sob refrigeração a, aproximadamente, 4ºC.

A análise de Listeria em dietas enterais foi feita em amostras de 25g acrescentadas de 225mL de caldo LEB (Difco) com suplemento seletivo SRE 142E (Oxoid) e homogeneizadas em stomacher por 2 minutos. O homogenato foi incubado a 30ºC por 26h e uma alíquota de 0,2mL foi transferida para caldo Fraser, para enriquecimento secundário. Após incubação por mais 30h a 35ºC, a verificação de colônias suspeitas de Listeria foi feita em ágar Oxford. Em todas as amostras coletadas, foi realizada, simultaneamente, a detecção de Listeria em imunoanalisador automático (Mini-Vidas, BioLab BioMérieux) em alíquotas de 500µL do caldo de enriquecimento secundário.

A confirmação do gênero Listeria foi feita por meio de teste de Gram e teste de motilidade em ágar semi-sólido SIM com incubação a 25ºC por 48h a 72h. A caracterização bioquímica dos isolados constou dos testes de fermentação de xilose, ramnose e manitol, da avaliação da atividade de b-hemólise e do teste CAMP, feitos em meio base para ágar sangue (Oxoid) suplementado com 5% de sangue de carneiro desfibrinizado¹⁰. Utilizaram-se culturas de S. aureus ATCC 25923 e Rhodococcus equi ATCC 33701 para o teste Camp.

Salmonella sp.

Os swabs com as amostras coletadas dos utensílios e equipamentos destinados à detecção de Salmonella, foram incubados em água peptonada tamponada 1% a 37ºC por 18h; após este período, alíquotas de 1mL foram transferidas para caldo Rappaport-Vassiliardis (RP) e caldo Selenito-Cistina (SC) para o enriquecimento seletivo, sendo incubados a 42ºC e 37ºC, respectivamente, por 24 horas¹⁰. De cada tubo, procedeu-se o isolamento de colônias típicas em ágar XLD e BPLS (Merck, Darmstsdt, Alemanha) por meio de estria composta com incubação por 24h a 37°C. Colônias suspeitas foram estriadas em ágar inclinado TSI e LIA (Merck), seguindo-se de incubação por 24h a 37ºC. Os isolados que apresentaram reações características de Salmonella sp. foram submetidos à identificação bioquímica com os seguintes testes: produção de urease, motilidade em meio SIM, produção de H₂S, utilização de citrato, produção de indol, fermentação do malonato e produção de fenilalanina. Os isolados que apresentaram resultado característico para Salmonella sp. nos testes bioquímicos foram avaliados por teste sorológico, com antisoro polivalente (antígeno O, Difco). A confirmação das colônias suspeitas de serem Salmonella sp. também foi feita em imunoanalisador MiniVidas (Biolab BioMerieux) a partir dos caldos de enriquecimento; a sorotipagem para reconhecimento da espécie foi conduzida no Laboratório de Zoonoses Bacterianas da Fundação Oswaldo Cruz, RJ.

Klebsiella sp.

Das amostras coletadas com swabs e das provenientes das dietas enterais foi feito o isolamento de Klebsiella, em meio seletivo MacConkey-inositol-carbenicilina (Merck)¹¹. Três a cinco colônias típicas de Klebsiella de cada amostra foram estriadas em ágar tripticaseina e soja-TSA (Oxoid) e mantidas em meio Infusão Cérebro e Coração-BHI (Oxoid) semi-sólido a 4ºC.

A identificação dos isolados foi feita por testes morfo-tintoriais e pelo sistema de identificação de bactérias Gram-negativas API 20E (API, LA Balme Les Grottes, França).

Susceptibilidade a antibióticos

A susceptibilidade dos isolados de Salmonella e Klebsiella aos agentes antimi-crobianos foi determinada pelo método de disco-difusão em ágar Mueller-Hinton (Oxoid), enquanto os isolados de Listeria foram avaliados em ágar TSA + 0,6% de extrato de levedura. Para Klebsiella e Salmonella, os antibióticos usados (Sensibiodisc-CECON, São Paulo, Brasil) foram: ácido nalidíxico-NAL (30µg), amicacina-AMI (30µg), amoxicilina-AMO (10µg), amoxicilina + ácido clavulânico-AMC (30µg/10µg), ampicilina-AMP (10µg), cloranfenicol-CLO (30µg), gentamicina-GEN (10µg), imipenem-IMP (30µg), kanamicina-KN (30µg), neomicina-NO (30µg), tetraciclina-TET (30µg), ticarcilina + ácido clavulânico-TIC (75µg/10µg) e trimetropim e sulfametoxazol-SUT (1,25/23,75µg). Para Listeria, os antibióticos usados foram: amicacina (30µg), ampicilina (10µg), cefalotina (30µg), cefotaxima (30µg), cefoxitina (30µg), cloranfenicol (30µg), eritromicina (15µg), gentamicina (10µg), kanamicina (30µg), tetraciclina (30µg) e tobramicina (10µg).

RESULTADOS

A análise das 50 amostras, distribuídas entre as amostras ambientais, as de equipamentos, de superfícies e as quatro amostras de dietas enterais, resultou no isolamento de três colônias típicas de bactérias do gênero Listeria, cinco do gênero Salmonella e oito do gênero Klebsiella. Os resultados da identificação bioquímica evidenciaram que seis amostras (11%) apresentavam-se contaminadas com, pelo menos uma das bactérias analisadas (Tabela 1).

A presença de colônias típicas do gênero Listeria na amostra de dieta enteral foi detectada ao utilizar-se a técnica convencional, que compreende o enriquecimento primário, secundário e isolamento em meio seletivo e ao avaliar-se a mesma amostra em imunoanalisador MiniVidas. Os testes bioquímicos conduzidos identificaram os isolados como pertencentes à espécie L. monocytogenes.

Salmonella também foi isolada em amostra de dieta enteral (Tabela 1) tanto pelo procedimento convencional como pelo teste imunoanalítico. A identificação sorológica conduzida na Fundação Osvaldo Cruz (FIOCRUZ) indicou tratar-se de Salmonella rissen 6767 Fg monoflagelar.

Dos oito isolados suspeitos de serem Klebsiella sp, selecionados pela morfologia típica da colônia em ágar MacConkey-carbenicilina-inositol, a identificação bioquímica reconheceu apenas dois como pertencentes à espécie K. pneumoniae e três à espécie K. oxytoca. Os demais isolados não foram conclusivamente identificados.

Os isolados de L. monocytogenes avaliados apresentaram resistência intermediária apenas ao antibiótico cefoxitina, e sensibilidade aos demais antibióticos avaliados. Constatou-se também uma elevada sensibilidade dos isolados de Salmonella e de Klebsiella aos antibióticos testados, embora os isolados de Klebsiella apresentassem resistência à ampicilina e à amoxilina.

DISCUSSÃO

A presença de patógenos verificada nos ambientes, utensílios e equipamentos de processamento do serviço de alimentação hospitalar, alerta para o risco da contaminação cruzada dos alimentos que podem veicular tais patógenos para os pacientes. Além disso, os resultados indicam que as práticas de limpeza e sanitização não estão sendo suficientes para eliminar tais patógenos. Lisboa¹² constatou uma grande variação na contaminação de manipuladores, utensílios e superfícies de processamento de alimentos por bactérias Gram-negativas em ambiente de cozinha hospitalar, onde cerca de 80% dos contaminantes pertenciam à família Enterobacteriaceae, incluindo Salmonella sp., Escherichia coli, Shigella sp. e Yersinia enterocolitica. Sammarco et al.¹³ relataram que se faz necessária a aplicação de sanitizantes mais potentes e adoção de boas práticas de higiene para prevenir a contaminação com L. monocytogenes, Salmonella sp. e Y. enterocolitica em unidades industriais de processamento de carne. Sugere-se que tais práticas sejam estendidas à cozinha hospitalar.

K. pneumoniae foi isolada de uma colher de madeira, utensílio não recomendado para o preparo de alimentação, devido à sua alta porosidade, que dificulta a higienização e favorece o crescimento microbiano.

A presença de L. monocytogenes e de Salmonella sp. em dietas enterais pode ser resultante de contaminação cruzada e desperta uma grande preocupação quanto à saúde dos pacientes. L. monocytogenes é um patógeno de risco para pessoas imunodeprimidas, um quadro geralmente presente em pessoas que recebem esse tipo de dieta. A ocorrência de L. monocytogenes e de Salmonella sp. em dietas enterais classifica esse alimento como impróprio para consumo de acordo com o Regulamento Técnico que fixa os requisitos mínimos exigidos para terapia de nutrição enteral estabelecidos na RDC nº 63 de 6 de julho de 2000¹⁴. Dietas enterais constituem um substrato para crescimento rápido de bactérias e, nas condições geralmente adotadas de tempo e temperatura de admi-nistração, Salmonella sp. pode apresentar um tempo de geração entre 24 e 34 minutos¹⁵, alcançando números elevados, mesmo que a contaminação inicial tenha sido baixa.

Uma observação importante foi que as dietas enterais contaminadas com L. monocytogenes ou com Salmonella sp. foram aquelas submetidas a uma maior manipulação, pois continham maior número de ingredientes para mistura e homogeneização. Nessa situação, a contaminação pode ser atribuída tanto aos ingredientes utilizados quanto às práticas inadequadas de manipulação. Segundo Freedland et al.¹⁶, uma taxa de 30% a 90% de contaminação em sistemas de alimentação enteral está normalmente associada à falta de atenção dos manipuladores para com as técnicas de higiene adequadas, à inabilidade para sanitizar equipamentos de preparação e aos ingredientes aditivos não estéreis ou contaminados adicionados às dietas.

Estes resultados alertam para a necessidade de implantação de um sistema de controle microbiológico na área de manipulação de alimentos, controle que deve ser estendido aos funcionários envolvidos nesse processo. O sistema APPCC - Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle - tem por objetivos identificar e prevenir situações, locais ou ações em que estejam presentes perigos de contaminação de alimentos por patógenos. Trata-se de uma ferramenta indispensável no processo de garantia de higiene de alimentos, especialmente dos destinados a grupos de risco. De acordo com Oliveira et al.¹⁷, a implantação do sistema APPCC durante a preparação, estocagem, distribuição e entrega das dietas aos pacientes resulta em uma melhora significativa da qualidade microbiológica das mesmas. Juntamente com a implementação do sistema APPCC, um treinamento do pessoal envolvido no que diz respeito à lavagem correta das mãos, práticas de higiene, limpeza e desinfecção de recipientes e materiais que entram em contato com as dietas, controle de temperatura adequado e roupas adequadas com protetores têm reduzido o risco de contaminação de dietas reconstituídas. Almeida et al.¹⁸ destacaram a implantação do APPCC, como uma estratégia para melhorar a qualidade de fórmulas infantis preparadas em hospitais; como resultado, verificaram uma redução significativa na conta-minação de utensílios e mãos de manipuladores de alimentos. A adoção desse sistema nos setores de alimentação dos hospitais certamente irá trazer grandes melhorias na qualidade e inocuidade dos alimentos e dietas preparados nesses locais.

A sensibilidade dos isolados à maioria dos antibióticos avaliados difere da expectativa de que a microbiota contaminante de alimentos, manipuladores, ambientes e utensílios em cozinhas hospitalares geralmente apresenta um perfil de maior resistência a antibióticos do que a microbiota de outros ambientes de preparo de alimentos¹⁹. Resultados de Lisboa¹² mostraram que Salmonella sp. presente em ambientes de preparo de alimentos em hospital apresentaram-se resistentes a cloranfenicol e tetraciclina, enquanto os isolados de Klebsiella sp. foram resistentes a ampicilina, kanamicina e tetraciclina. Na maioria dos isolados resistentes aos antibióticos (78%), esse autor constatou a presença de DNA plasmidial que pode conter genes responsáveis pela resistência a um ou mais antibióticos e que podem ser disseminados intra e interespécies bacterianas, contribuindo para o insucesso das terapias antimicrobianas. Perfil de resistência semelhante ao encontrado no presente estudo, foi registrado por Pereira¹¹ num estudo em que todos os 21 isolados de Klebsiella sp. de dietas enterais foram resistentes aos antibióticos amoxicilina e ampicilina.

A resistência de L. monocytogenes isolada da dieta enteral ao antibiótico cefoxitina também foi encontrada em isolados de L. monocytogenes provenientes de carne e leite²⁰. Os autores desses estudos verificaram também nos isolados um índice elevado de resistência a cefotaxima, amicacina, cloranfenicol, tetraciclina, eritromicina, tobramicina, gentamicina, cefalotina e ampicilina.

CONCLUSÃO

Os dados obtidos alertam para a necessidade de implantação de um rigoroso sistema de controle de qualidade microbiológica nas áreas de manipulação dos alimentos e das dietas enterais, incluindo as boas práticas de fabricação e APPCC.

AGRADECIMENTOS

À FAPEMIG, pelo apoio financeiro e bolsa de Iniciação Científica. À FIOCRUZ na pessoa do Dr. Ernesto Hofer e Dra. Eliane Moura Flavina dos Reis, pela sorotipagem do isolado de Salmonella.

Recebido para publicação em 2 de setembro de 2002 e aceito em 8 de agosto de 2003.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  26 Out 2004
• Data do Fascículo
  Set 2004

Histórico

• Aceito
  08 Ago 2003
• Recebido
  02 Set 2002