Aflatoxins in foodstuffs: current concepts on mechanisms of toxicity and its involvement in the etiology of hepatocellular carcinoma

rsp Revista de Saúde Pública Rev. Saúde Pública 0034-8910 1518-8787 Faculdade de Saúde Pública da Universidade de São Paulo São Paulo, SP, Brazil Current concepts derived from intensive research over the last decade, on biotransformation, mechanisms of toxicity and evidences for the involvement of aflatoxins in the etiolgy of human liver cancer are summarily presented. Aflatoxin B1(AFB1), the main metabolite produced by moulds of genus Aspergillus, exerts its effects after conversion to the reactive compound AFB1-epoxide, by the action of cytochrome P450-dependent enzymes. This epoxide can form derivatives with cellular macromolecules, including proteins, RNA and DNA. The reaction with DNA occurs with guanines in the códon 249 of tumor suppressor gene p53. Primary biotransformation of AFB1 also produces hydroxylated and less toxic derivatives, such as aflatoxins Q1 and P1. Differences intra and interspecies in the pathways of activation/detoxification are directly related to the susceptibility of animals to aflatoxin effects. In humans, studies of individual biomonitoring of AFB1 metabolites such as AFB1-N7-guanine have demonstrated that aflatoxins constitute an important risk factor for hepatocellular carcinoma (HCC) in exposed populations. Some of these studies also show a synergistic action between aflatoxins and the hepatitis B virus in the development of human HCC. In view of these concepts, and taking into account the frequent detection of aflatoxins in Brazilian foodstuffs, the need for investigation into the level of exposure to these toxins and its impact on human health is stressed. Aflatoxinas: conceitos sobre mecanismos de toxicidade e seu envolvimento na etiologia do câncer hepático celular Aflatoxins in foodstuffs: current concepts on mechanisms of toxicity and its involvement in the etiology of hepatocellular carcinoma Carlos Augusto Fernandes de Oliveira e Pedro Manuel Leal Germano Departamento de Produção Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo (USP). São Paulo, SP - Brasil (C.A.F.O.), Departamento de Prática de Saúde Pública da Faculdade de Saúde Pública da USP. São Paulo, SP - Brasil (P.M.L.G.) Resumo Foram revistos os conceitos de maior relevância sobre mecanismos de toxicidade e evidências do envolvimento das aflatoxinas na etiologia do câncer hepático humano. A aflatoxina B1 (AFB1), principal metabólito produzido por fungos do gênero Aspergillus, manifesta seus efeitos tóxicos após conversão hepática em AFB1-epóxido, o qual reage com macromoléculas celulares, incluindo proteínas, RNA (ácido ribonucléico) e DNA (ácido desoxirribonucléico). A reação com o DNA ocorre através da ligação com guaninas, ao nível do códon 249, do gene supressor de tumores p53. Em seres humanos, estudos de biomonitoramento individual de derivados AFB1-N7-guanina tem demonstrado que as aflatoxinas constituem importantes fatores de risco, com uma provável interação sinergística com o vírus da hepatite B, para o desenvolvimento do carcinoma hepatocelular em populações expostas. Considerando-se a ocorrência freqüente das aflatoxinas em produtos alimentícios, no Brasil, ressalta-se a necessidade de estudos que avaliem criteriosamente o impacto dos níveis de exposição a estas toxinas sobre a saúde humana. Carcinoma hepatocelular, etiologia. Aflatoxinas, toxicidade. Alimentos, toxicidade. Abstract Current concepts derived from intensive research over the last decade, on biotransformation, mechanisms of toxicity and evidences for the involvement of aflatoxins in the etiolgy of human liver cancer are summarily presented. Aflatoxin B1(AFB1), the main metabolite produced by moulds of genus Aspergillus, exerts its effects after conversion to the reactive compound AFB1-epoxide, by the action of cytochrome P450-dependent enzymes. This epoxide can form derivatives with cellular macromolecules, including proteins, RNA and DNA. The reaction with DNA occurs with guanines in the códon 249 of tumor suppressor gene p53. Primary biotransformation of AFB1 also produces hydroxylated and less toxic derivatives, such as aflatoxins Q1 and P1. Differences intra and interspecies in the pathways of activation/detoxification are directly related to the susceptibility of animals to aflatoxin effects. In humans, studies of individual biomonitoring of AFB1 metabolites such as AFB1-N7-guanine have demonstrated that aflatoxins constitute an important risk factor for hepatocellular carcinoma (HCC) in exposed populations. Some of these studies also show a synergistic action between aflatoxins and the hepatitis B virus in the development of human HCC. In view of these concepts, and taking into account the frequent detection of aflatoxins in Brazilian foodstuffs, the need for investigation into the level of exposure to these toxins and its impact on human health is stressed. Carcinoma, hepatocellular, etiology. Aflatoxins, toxicity. Foods, toxicity. INTRODUÇÃO As aflatoxinas são metabólitos secundários, produzidos por algumas cepas de fungos do gênero Aspergillus, principalmente das espécies A.flavus e A.parasiticus, os quais desenvolvem-se naturalmente em produtos alimentícios, como amendoim, milho, feijão, arroz e trigo, entre outros31. São conhecidos, atualmente, 17 compostos similares designados pelo termo aflatoxina, porém, os principais tipos de interesse médico-sanitário são identificados como B1, B2, G1 e G231. Estes compostos caracterizam-se pela elevada toxicidade que apresentam. Em saúde animal, várias espécies domésticas e de experimentação são sensíveis aos seus efeitos tóxicos agudos, mutagênicos, carcinogênicos e teratogênicos, sendo o fígado o principal órgão atingido32. A aflatoxina B1 (AFB1) é a que apresenta maior poder toxigênico, seguida de G1, B2 e G212. De modo análogo, em saúde pública, as aflatoxinas têm sido identificadas como fatores envolvidos na etiologia do câncer hepático no homem, conseqüente à ingestão de alimentos contaminados5,24. Existem evidências de que outras doenças, como a síndrome de Reye31 e o kwashiorkor22, também são associadas às aflatoxinas. A hipótese de associação causal entre a ingestão de aflatoxinas e o desenvolvimento de enfermidades humanas continua sendo, ainda hoje, objeto de controvérsias20. Mesmo assim, desde a descoberta das aflatoxinas, em 1960, diversos países adotaram limites de tolerância para essas toxinas em produtos destinados ao consumo humano. O Brasil, com base nos conhecimentos então disponíveis, estabeleceu, em 1977, o limite de 30 µg/kg para a soma das frações B1 e G1 em qualquer tipo de alimento6. Desconhece-se, contudo, se este valor ainda representa ou não risco significativo para o desenvolvimento do câncer hepático. Na última década, porém, intensas pesquisas contribuíram para melhor caracterizar os possíveis efeitos das aflatoxinas sobre a saúde humana, com destaque para os experimentos sobre a atividade biológica da AFB1 nas células hepáticas, no âmbito molecular, e sua aplicação em estudos populacionais. No presente artigo faz-se uma revisão dos conceitos de maior relevância derivados dessas pesquisas, bem como as principais evidências da participação das aflatoxinas na etiologia do câncer hepático no homem. MECANISMOS DE TOXICIDADE DA AFLATOXINA B1 As aflatoxinas são absorvidas no trato gastrointestinal e biotransformadas primariamente no fígado, por enzimas microssomais do sistema de funções oxidases mistas4. Estas enzimas, pertencentes à superfamília de enzimas do citocromo P-450, constituem parte do processo de detoxificação de uma ampla variedade de xenobióticos no organismo15. A biotransformação da AFB1, particularmente, tem sido estudada com maior interesse, uma vez que guarda estreita relação com seus mecanismos de ação tóxica. Existe atualmente consenso, entre grande número de especialistas, de que a AFB1 é, na realidade, um pró-carcinógeno, o qual requer ativação metabólica para manifestar seus efeitos tóxicos4,23,46. A forma ativada da AFB1 é o composto identificado como 8,9-óxido de AFB1, ou AFB1-epóxido (anteriormente denominado AFB1-2,3 epóxido), originado através da epoxidação da dupla ligação do éter vinílico, presente na estrutura bi-furanóide da molécula de AFB14. Este composto é altamente eletrofílico e capaz de reagir rapidamente, através de ligações covalentes, com sítios nucleofílicos de macromoléculas, como ácido desoxirribonucléico (DNA), ácido ribonucléico (RNA) e proteínas4. Estas ligações determinam a formação de adutos, os quais representam a lesão bioquímica primária produzida pelas aflatoxinas23. A AFB1-epóxido pode também ser conjugada enzimaticamente com glutationa reduzida, através de glutationa-S-transferases, constituindo importante via de detoxificação deste composto21. A ligação da AFB1-epóxido com o DNA modifica a sua estrutura e, conseqüentemente, a sua atividade biológica, originando assim os mecanismos básicos dos efeitos mutagênicos e carcinogênicos da AFB123. A formação de adutos ocorre através da ligação com guaninas da molécula de DNA, na posição N7, ao nível do códon 249, do gene supressor de tumores p5323. A ocorrência deste tipo de alteração é característica de vários carcinomas no homem, sobretudo o hepático7,19,33,36. Estudos efetuados em fígados de ratos demonstraram que os adutos AFB1-N7-guanina podem ser retirados após a sua formação, deixando sítios apurínicos na molécula de DNA23. Os sítios vagos tendem a ser preenchidos com adenina, resultando em transversão de guanina para timina, o que origina um ponto de mutação bastante significativo1. Os adutos de DNA, depois de sofrerem depurinação espontânea, podem ser conjugados e excretados, sobretudo através da urina18. O processo de carcinogênese, fundamentado em trabalhos experimentais, envolve, geralmente, duas fases distintas, a iniciação e a promoção do câncer19,25. A fase de iniciação é resultante de alterações mutagênicas nas células, ao passo que a de promoção relaciona-se com a expressão fenotípica das modificações ocorridas na primeira fase19,25. Neste contexto, as mutações determinadas pelas aflatoxinas representam alterações genéticas permanentes nas células afetadas, o que possibilita a iniciação do processo cancerígeno23. Os adutos de RNA e de proteínas determinam lesões bioquímicas, as quais devem, provavelmente, estar envolvidas com os mecanismos de toxicidade aguda da AFB1, dado que conduzem à morte celular pela inativação de macromoléculas essenciais às células23. A formação destes adutos inicia-se com a hidrólise da AFB1-epóxido para produzir 8,9-dihidro-8,9-dihidroxi-B1 (ou B1-diol), o qual reage com amino-grupos primários de proteínas, originando bases de Schiff9. Os principais adutos de proteínas são formados com albumina, durante a sua síntese nos hepatócitos9. Além da epoxidação, a biotransformação primária da AFB1 inclui a hidroxilação, para formar as aflatoxinas M1, Q1 e B2a; e, O-demetilação, para formar aflatoxina P14. Todos estes compostos contêm o grupo hidroxila na molécula, o que permite a conjugação com ácido glicurônico ou sulfatos4. Conseqüentemente, são bastante solúveis em água, possibilitando sua rápida excreção através da urina ou bile e, em seguida, nas fezes4. Este fato sugere que a formação destes derivados pode constituir parte do processo de detoxificação da AFB1, embora alguns produtos, como a aflatoxina M1, apresentem, também, toxicidade apreciável em modelos experimentais23. Diversos autores consideram que a potência dos efeitos da AFB1, bem como de seus derivados, sobre células ou organismos, depende, entre outros fatores, do balanço integrado entre as múltiplas vias, tanto de ativação metabólica, quanto de detoxificação15,28,29. Os padrões de biotransformação da AFB1 variam consideravelmente entre as espécies animais, e mesmo entre indivíduos da mesma espécie, o que poderia justificar os diferentes graus de susceptibilidade à AFB1 observados em cada uma delas. CARCINOGENICIDADE DA AFLATOXINA B1 Estudos em Animais de Experimentação A carcinogênese hepática representa o mais importante efeito de toxicidade crônica das aflatoxinas. Esta capacidade tem sido demonstrada extensivamente, sobretudo em relação à AFB1, em muitas espécies animais, incluindo peixes, aves, roedores, carnívoros e primatas9. Nestes animais, a AFB1 induz à formação de carcinoma hepatocelular (CHC), mesmo quando ingerida em quantidades muito baixas, o que permite considerá-la como um dos mais potentes hepatocarcinógenos naturais12. Embora o fígado seja o alvo primário, o desenvolvimento de tumores em outros órgãos, como pâncreas e intestino, tem sido observado em animais alimentados com rações contendo aflatoxinas9. Existem inúmeros estudos sobre a carcinogenicidade da AFB1 em diferentes espécies animais, sendo que diversas revisões encontram-se publicadas9,12,31,46. A dose efetiva de AFB1 ingerida para a indução de tumores hepáticos varia amplamente entre as espécies, de modo similar ao que ocorre em relação à toxicidade aguda. Peixes e aves são extremamente sensíveis, e a dose efetiva para a indução de hepatomas situa-se entre 10 - 30 µg/kg de AFB1 na dieta46. Contudo, a sensibilidade é particularmente variável entre os roedores, sendo que os ratos respondem nos níveis de 15 - 1.000 µg/kg de AFB1 na dieta, enquanto que certas cepas de camundongos não apresentam nenhuma resposta em doses de até 150.000 µg/kg46. Para a maioria das espécies estudadas, a sensibilidade é acentuadamente maior nos machos do que nas fêmeas46. A comparação quantitativa da potência carcinogênica da AFB1 entre as espécies animais pode ser facilitada pelo cálculo estatístico da dose média para a produção de tumores (DT50), pelo método de Gold e col.16, expressa em µg/kg p.c./dia. Os valores da DT50 apresentados na Tabela 1 refletem, entre outros fatores, as diferenças intra e interespécies observadas na biotransformação da AFB1, particularmente em relação aos mecanismos de bioativação e detoxificação. Por exemplo, a habilidade de ativar a AFB1, para a formação do epóxido, é mais eficiente em preparações enzimáticas de fígado de ratos, do que de primatas, incluindo o homem; por outro lado, observa-se o oposto em relação à capacidade de formação de derivados hidrossolúveis e conseqüente detoxificação da AFB128. Carcinogenicidade para a Espécie Humana O CHC é, mundialmente, um dos tipos mais comuns de câncer, apresentando, porém, uma acentuada variação geográfica no que concerne à incidência, com predomínio em alguns países da África, Ásia e ilhas do Pacífico34. A incidência do CHC é maior nos homens do que nas mulheres, predominantemente na faixa etária de 30 - 50 anos26. Entre os países com maior incidência, destacam-se Moçambique, Zimbabwe, Etiópia, China (costa sudoeste) e Taiwan26. Os países com incidência intermediária incluem Swazilândia, Transkei, Japão e os da parte central e sudoeste da Europa26. As diferenças extremas observadas na incidência do CHC entre os diversos países sugerem o envolvimento de fatores ambientais em sua etiologia. Dentre os fatores identificados, os que apresentam maior importância são as aflatoxinas e o vírus da hepatite B (HBV)19. Diversos autores têm reportado à presença de aflatoxinas no soro30 e em biópsias de fígado de pacientes com câncer hepático13. Entretanto, a hipótese de que a ingestão de aflatoxinas constitui fator de risco para o CHC no homem é melhor amparada por evidências experimentais e epidemiológicas. As experimentais derivam da extrapolação para o homem, dos resultados obtidos em estudos de biotransformação, mutagenicidade e carcinogenicidade em animais e em preparações in vitro29. As evidências epidemiológicas resultam de estudos efetuados em áreas geográficas onde a contaminação de alimentos por aflatoxinas e o CHC são freqüentes5,8. Os resultados de alguns desses trabalhos, onde se constatou uma forte associação estatística entre a incidência de câncer hepático e o grau de exposição às aflatoxinas, são apresentados na Tabela 2. Esta associação é mais evidente em indivíduos do sexo masculino8. Com base nos estudos disponíveis, a "International Agency for Research on Cancer" (IARC)24 concluiu, em 1987, que existiam evidências suficientes para considerar a AFB1 como fator etiológico do câncer hepático em populações humanas. A análise global dos dados sobre a ingestão de aflatoxinas versus incidência do CHC, pelo método de Gold e col.16, forneceu, de acordo com Wogan46 (1992), uma DT50 igual a 132 µg/kg p.c./dia. Este valor está próximo da DT50 observada em algumas espécies de primatas, porém, é consideravelmente superior às das espécies de roedores mais sensíveis (Tabela 1). Ao comparar esses valores, entretanto, deve-se ressaltar que a DT50 para o homem é teórica, uma vez que, para o seu cálculo, foram assumidas várias condições, entre elas, a de que a AFB1 seja a única causa do CHC e que a exposição a este carcinógeno tenha ocorrido continuamente durante cerca de 50 anos da vida do indivíduo46. Apesar da consistência dos dados apresentados na Tabela 2, não existe, até o presente, uma caracterização completa da relação dose-resposta para as aflatoxinas no homem. Isto se deve, entre outras causas, ao fato de que, nos estudos epidemiológicos, o grau de exposição não é preciso, uma vez que foi estimado a partir dos níveis de contaminação por AFB1 na dieta das populações, e não na dose efetivamente ingerida individualmente, tal como ocorre em animais submetidos à experimentação5. De acordo com Stoloff41 (1987), a comprovação científica do envolvimento das aflatoxinas na etiologia do câncer hepático, no homem, é dificultada pelo fato de que, em sua grande maioria, os estudos epidemiológicos foram realizados em áreas onde a infecção pelo HBV é endêmica e, também, correlacionada à incidência do CHC. Esta afirmativa encontra respaldo em alguns estudos posteriores, como o efetuado por Cambpbell e col.10 (1990), os quais não observaram relação entre a ingestão de aflatoxinas e a mortalidade por CHC em 48 áreas da República Popular da China, ao contrário da prevalência de portadores do antígeno de superfície da hepatite B (HBsAg), a qual revelou-se fortemente associada ao CHC. Esse trabalho, entretanto, foi severamente criticado por Wild e Montesano45 (1991), notadamente em relação à metodologia empregada para estimar o grau de exposição dos indivíduos às aflatoxinas. O HBV é considerado o principal fator de risco para o câncer hepático em certas populações, como a de Taiwan. Nesse país, estudos prospectivos demonstraram que existe uma alta incidência do CHC em portadores de HBV3. Inversamente, em estudos clínicos, grande parte dos pacientes com CHC revelaram-se HBsAg seropositivos2. Seqüências do vírus HBV têm sido encontradas no genoma de hepatócitos de pacientes com CHC, embora esta integração não constitua componente obrigatório do câncer hepático ou da hepatite crônica46. As conclusões da IARC, porém, foram bastante favorecidas a partir do final da década de 80, pelos resultados obtidos em estudos de biomonitoramento individual de adutos de AFB1 com proteínas e DNA em populações expostas, sobretudo na China. Isto possibilitou uma quantificação mais precisa do grau de exposição às aflatoxinas. Groopman e col.17 (1988) concluíram que, no homem, cerca de 1 - 2% da AFB1 ingerida liga-se covalentemente à albumina plasmática, e que a dosagem destes adutos evidencia exposição à AFB1 ao longo de aproximadamente 20 dias. Wild e col.44 (1990) pesquisaram a presença de adutos de albumina plasmática em adultos e crianças de vários países, como Kenia, Senegal, Gâmbia e Uganda, observando positividade entre 12 - 100% das amostras. Na Tailândia, os níveis destes adutos foram menores, sendo que nenhuma amostra foi positiva entre indivíduos da Polônia e França. Esses resultados são compatíveis com as incidências do CHC nos países citados. Estudos experimentais demontraram que a formação de adutos AFB1-DNA é diretamente proporcional à dose de AFB1 ingerida, e à indução de tumores hepáticos em animais expostos11. Com relação a seres humanos, Groopman e col.18 (1992) observaram uma alta correlação entre a ingestão total de AFB1 e a excreção urinária total de adutos AFB1-N7-guanina. Com base nestes fatos, Ross e col.37 (1992), em estudo prospectivo realizado em Shangai, República Popular da China, evidenciaram que a exposição às aflatoxinas potencializou o risco de câncer hepático associado ao HBV. Os autores observaram que o risco relativo para os indivíduos com seropositividade para o HBsAg, e com presença de adutos AFB1-N7-guanina na urina, foi de 60,1; em contraste, o risco relativo para os indivíduos com seropositividade para o HBsAg, e com ausência de adutos e outros derivados da AFB1 na urina, foi de 4,8. Apesar da intensa discussão sobre este assunto, a tendência atual entre os pesquisadores, de modo geral, é considerar a etiologia do câncer hepático como multifatorial, com uma provável interação sinergística entre as aflatoxinas, atuando como iniciadoras do processo cancerígeno, e o HBV, o qual teria um efeito promotor sobre o desenvolvimento do tumor (fenótipo transformado)19,46,48. Cova e col.14 (1990), experimentalmente, observaram ação sinergística entre a AFB1 e o vírus da hepatite B de patos (DHBV), no desenvolvimento de hepatomas em animais expostos a ambos os fatores. Este mesmo efeito foi constatado por Sell e col.40 (1991), com relação a camundongos transgênicos, ou seja, com seqüências do HBV no genoma, expostos à ingestão de AFB1. No Brasil, apesar da legislação em vigor, a ocorrência de aflatoxinas tem sido observada com freqüência, e em altos níveis, principalmente no Estado de São Paulo, em alimentos utilizados para consumo humano e animal, como, milho38, amendoim e derivados39. A contaminação de derivados de amendoim, como paçocas e outros doces, assume destacada relevância em saúde pública, dado que as crianças constituem os principais consumidores desses produtos. Contudo, não existem estimativas acerca do grau de exposição da população através da ingestão de alimentos contaminados. Desconhece-se, também, o impacto das aflatoxinas sobre a incidência do CHC ou outras doenças, em nossas condições. Tendo em vista os conceitos apresentados, bem como os princípios básicos para a avaliação do risco à saúde representado por contaminantes químicos em alimentos47, considera-se fundamental a realização, no Brasil, de estudos sobre: • a mensuração dos níveis de exposição da população às aflatoxinas, mediante a utilização de técnicas atuais de biomonitoramento de derivados metabólicos da AFB1; • a avaliação dos níveis de exposição encontrados, à luz dos conhecimentos disponíveis, paticularmente em relação à atividade biológica da AFB1 em células humanas; • a contribuição das aflatoxinas para a incidência do CHC na população, considerando-se os níveis de exposição através dos alimentos contaminados, excluídas outras possíveis causas, como o HBV. O esclarecimento dessas questões poderá contribuir para uma melhor caracterização do risco à saúde humana representado pelo consumo de alimentos contaminados com aflatoxinas, bem como orientar a revisão e a elaboração de normas legais de tolerância para essas toxinas. Edição subvencionada pela FAPESP. Processo 96/5999-9. Correspondência para/Correspondence to: Pedro Manuel Leal Germano - Av. Dr. Arnaldo, 715 - 01246-904 São Paulo, SP - Brasil. E-mail: [e-mail] Recebido em 10.6.1996. Reapresentado em 14.3.1997. Aprovado em 15.4.1997. 1. AGUILLAR, F.; HUSSAIN, S.P.; CERUTTI, P. Aflatoxin B1 induces the transversion of G>T in códon 249 of the p53 tumor suppressor gene in human hepatocytes. Proc. Natl. Acad. Sci., 90: 8586-90, 1993. Aflatoxin B1 induces the transversion of G—>T in códon 249 of the p53 tumor suppressor gene in human hepatocytes Proc. Natl. Acad. Sci. 1993 8586 90 90 AGUILLAR F HUSSAIN S.P CERUTTI P. 2. BEASLEY, R.P. Hepatitis B virus: the major etiology of hepatocellular carcinoma. Cancer, 61: 1942-56, 1988. Hepatitis B virus: the major etiology of hepatocellular carcinoma Cancer 1988 1942 56 61 BEASLEY R.P 3. BEASLEY, R.P.; HWANG, L.Y.; LIN, C.C.; CHIEN, C.S. Hepatocellular carcinoma and hepatitis B virus: a prospective study of 22.707 men in Taiwan. Lancet, 2: 1129-33, 1981. Hepatocellular carcinoma and hepatitis B virus: a prospective study of 22.707 men in Taiwan Lancet 1981 1129 33 2 BEASLEY R.P HWANG L.Y. LIN C.C. CHIEN C.S. 4. BIEHL, M.L. & BUCK, W.B. Chemical contaminants: their metabolism and their residues. J. Food Protec., 50: 1058-73, 1987. Chemical contaminants: their metabolism and their residues J. Food Protec. 1987 1058 73 50 BIEHL M.L BUCK W.B 5. BOSCH, F.X. & PEERS, F. Aflatoxins: data on human carcinogenic risk. In: ONeill, I.K.; Chen, J.; Bartsch, H., ed. Relevance to human cancer of N-nitroso compounds, tobacco smoke and mycotoxins. Lyon, IARC, 1991. p.48-53. (IARC Scientific Publications, 105). Relevance to human cancer of N-nitroso compounds, tobacco smoke and mycotoxins 1991 48 53 BOSCH F.X. PEERS F O’Neill I.K. Chen J. Bartsch H. 6 6. BRASIL. Comissão Nacional de Normas e Padrões para Alimentos. Resolução nº 34/76; fixa limites de tolerância para as aflatoxinas em alimentos. Diário Oficial da União, Brasília, 19 jan. 1977. Seção I, p.710. Resolução nº 34/76; fixa limites de tolerância para as aflatoxinas em alimentos. Diário Oficial da União 19 1977 01 710 7. BRESSAC, B.; KEW, M.; WANDS, J.; OZTURK, M. Selective G to T mutations of p53 gene in hepatocellular carcinoma from southern Africa. Nature, 350: 429-31, 1991. Selective G to T mutations of p53 gene in hepatocellular carcinoma from southern Africa Nature 1991 429 31 350 BRESSAC B. KEW M. WANDS J OZTURK M. 8. BRUCE, R.D. Risk assessment for aflatoxin. II. Implications of human epidemiology data. Risk Anal., 10: 561-9, 1990. Risk assessment for aflatoxin: Implications of human epidemiology data Risk Anal. 1990 561 9 10 BRUCE R.D 9. BUSBY, W.F. & WOGAN, G.N. Aflatoxins. In: Searle, C.E., ed. Chemical carcinogens. 2nd ed. Washington, American Chemical Society, 1984. v.2., p.945-1136. Chemical carcinogens 1984 945 1136 BUSBY W.F. WOGAN G.N. Searle C.E. 10. CAMPBELL, T.C.; CHEN, J.; LIU, C.; LI, J.; PARPIA, B. Nonassociation of aflatoxin with primary liver cancer in a cross-sectional ecological survey in the Peoples Republic of China. Cancer Res., 50: 6882-93, 1990. Nonassociation of aflatoxin with primary liver cancer in a cross-sectional ecological survey in the People’s Republic of China Cancer Res. 1990 6882 93 50 CAMPBELL T.C. CHEN J. LIU C. LI J. PARPIA B 11. CHOY, W.N. A review of the dose-response induction of DNA adducts by aflatoxin B1 and its implications to quantitative cancer-risk assessment. Mutat. Res., 296: 181-98, 1993. A review of the dose-response induction of DNA adducts by aflatoxin B1 and its implications to quantitative cancer-risk assessment Mutat. Res 1993 181 98 296 CHOY W.N. 12. COULOMBE, R.A. Aflatoxins. In: Sharma, R.P. & Salunkhe, D.K. Mycotoxins and phytoalexins. Boca Raton, CRC Press, 1991. p.103-43. Mycotoxins and phytoalexins. 1991 103 43 COULOMBE R.A Sharma R.P. Salunkhe D.K. 13. COULTER, J.B.S. Aflatoxins in liver biopsie from Sudanese children. Am. J. Trop. Med. Hyg., 35: 365-7, 1986. Aflatoxins in liver biopsie from Sudanese children Am. J. Trop. Med. Hyg. 1986 365 7 35 COULTER J.B.S 14. COVA, L.; WILD, C.P.; MEHROTRA, R.; TURUSOV, V.; SHIRAI, T.; LAMBERT, V.; JACQUET, C.; TOMATIS, L.; TRÉPO, C.; MONTESANO, R. Contribution of aflatoxin B1 and hepatitis B virus infection in the induction of liver tumors in ducks. Cancer Res., 50: 2156-63, 1990. Contribution of aflatoxin B1 and hepatitis B virus infection in the induction of liver tumors in ducks Cancer Res 1990 2156 63 50 COVA L. WILD C.P. MEHROTRA R. TURUSOV V. SHIRAI T. LAMBERT V. JACQUET C. TOMATIS L. TRÉPO C. MONTESANO R. 15. FORRESTER, L.M.; NEAL, G.E.; JUDAH, D.J.; GLANCEY, M.J.; WOLF, C.R. Evidence for involvement of multiple forms of cytochrome P-450 in aflatoxin B1 metabolism in human liver. Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 8306-10, 1990. Evidence for involvement of multiple forms of cytochrome P-450 in aflatoxin B1 metabolism in human liver. Proc. Natl. Acad. Sci. 1990 8306 10 87 FORRESTER L.M. NEAL G.E. JUDAH D.J. GLANCEY M.J. WOLF C.R. 16. GOLD, L.S.; SAWYER, C.B.; MAGAW, R.; BLACKMAN, G.M.; DE VECIANA, M.; LEVINSON, R.; HOOPER, N.K.; HAVENDER, W.R.; BERNSTEIN, L.; PETO, R.; PIKE, M.C.; AMES, B.N. A carcinogenic potency database of the standardized results of animal bioassays. Environ. Health Perspect., 58: 9-322, 1984. A carcinogenic potency database of the standardized results of animal bioassays Environ. Health Perspect. 1984 9 322 58 GOLD L.S. SAWYER C.B. MAGAW R. BLACKMAN G.M. DE VECIANA M. LEVINSON R. HOOPER N.K. HAVENDER W.R. BERNSTEIN L. PETO R. PIKE M.C. AMES B.N. 17. GROOPMAN, J.D.; CAIN, L.G.; KENSLER, T.W. Aflatoxin exposure in human populations: measurements and relationship to cancer. CRC Crit. Rev. Toxicol., 19: 113-45, 1988. Aflatoxin exposure in human populations: measurements and relationship to cancer CRC Crit. Rev. Toxicol. 1988 113 45 19 GROOPMAN J.D. CAIN L.G. KENSLER T.W. 18. GROOPMAN, J.D.; JIAQI, Z.; DONAHUE, P.R.; PIKUL, A.; LISHENG, Z.; JUN-SHI, C.; WOGAN, G.N. Molecular dosimetry of urinary aflatoxin-DNA adducts in people living in Guangxi Autonomous region, Peoples Republic of China. Cancer Res., 52: 45-52, 1992. Molecular dosimetry of urinary aflatoxin-DNA adducts in people living in Guangxi Autonomous region, People’s Republic of China. Cancer Res. 1992 45 52 52 GROOPMAN J.D. JIAQI Z. DONAHUE P.R. PIKUL A. LISHENG Z. JUN-SHI C. WOGAN G.N. 19. HARRIS, C.C. Chemical and physical carcinogenesis: advances and perspectives for the 1990s. Cancer Res., 51(Suppl.): 5023s-44s, 1991. Cancer Res. 1991 5023s 44s 51 HARRIS C.C. 20. HARRISON, J.C.; CARVAJAL, M.; GARNER, R.C. Does aflatoxin exposure in the United Kingdom constitute a cancer risk? Environ. Health Perspect., 99: 99-105, 1993. Does aflatoxin exposure in the United Kingdom constitute a cancer risk Environ. Health Perspect. 1993 99 105 99 HARRISON J.C. CARVAJAL M. GARNER R.C. 21. HAYES, J.D.; JUDAH, D.J.; MCLELLAN, L.I.; NEAL, G.E. Contribution of the glutathione-S-transferases to the mechanisms of resistence to aflatoxin B1. Pharmacol. Ther., 50: 443-72, 1991. Contribution of the glutathione-S-transferases to the mechanisms of resistence to aflatoxin B1. Pharmacol. Ther. 1991 443 72 50 HAYES J.D. JUDAH D.J. MCLELLAN L.I. NEAL G.E. 22. HENDRICKSE, R.G. Kwashiorkor: the hypothesis that incriminates aflatoxins. Pediatrics, 88: 376-9, 1991. Kwashiorkor: the hypothesis that incriminates aflatoxins Pediatrics 1991 376 9 88 HENDRICKSE R.G 23. HSIEH, D.P.H.; ATKINSON, D.N. Bisfuranoid mycotoxins: their genotoxicity and carcinogenicity. Adv. Exp. Med. Biol., 283: 525-32, 1991. Bisfuranoid mycotoxins: their genotoxicity and carcinogenicity Adv. Exp. Med. Biol. 1991 525 32 283 HSIEH D.P.H. ATKINSON D.N. 24. INTERNATIONAL AGENCY FOR RESEARCH ON CANCER. Overall evaluations of carcinogenicity: an updating of IARC monographs volumes 1 to 2. Lyon, World Health Organization, 1987. p.83-7. (IARC monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans, Supplement 7). Overall evaluations of carcinogenicity: an updating of IARC monographs volumes 1 to 2 1987 83 7 25. KALDOR, J.M. & BOSCH, F.X. Multistage theory of carcinogenesis: the epidemiological evidence for liver cancer. Bull. Cancer, 14: 163-74, 1991. Multistage theory of carcinogenesis: the epidemiological evidence for liver cancer Bull. Cancer 1991 163 74 14 KALDOR J.M. BOSCH F.X. 26. KEEHN, D.M. & FRANK-STROMBORG, M. A worldwide perspective on the epidemiology and primary prevention of liver cancer. Cancer Nurs., 14: 163-74, 1991. A worldwide perspective on the epidemiology and primary prevention of liver cancer Cancer Nurs. 1991 163 74 14 KEEHN D.M. FRANK-STROMBORG M. 27. LINSELL, C.A. & PEERS, F.G. Aflatoxin and liver cell cancer. Trans. Soc. Trop. Med. Hyg., 71: 471-3, 1977. Aflatoxin and liver cell cancer Trans. Soc. Trop. Med. Hyg. 1977 471 3 71 LINSELL C.A. PEERS F.G. 28. MASSEY, T.E.; STEWART, R.K.; DANIELS, J.M.; LIU, L. Biochemical and molecular aspects of mammalian susceptibility to aflatoxin B1 carcinogenicity. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 208: 213-27, 1995. Biochemical and molecular aspects of mammalian susceptibility to aflatoxin B1 carcinogenicity Proc. Soc. Exp. Biol. Med 1995 213 27 208 MASSEY T.E. STEWART R.K. DANIELS J.M. LIU L. 29. McLEAN, M. & DUTTON, M.F. Cellular interactions and metabolism of aflatoxin: an update. Pharmacol. Ther., 65: 163-92, 1995. Cellular interactions and metabolism of aflatoxin: an update Pharmacol. Ther. 1995 163 92 65 McLEAN M. DUTTON M.F. 30. OLUBUYIDE, I.O. The natural history of primary liver cell carcinoma: a study of 89 untreated adult Nigerians. Cent. Afr. J. Med., 38: 25-30, 1992. The natural history of primary liver cell carcinoma: a study of 89 untreated adult Nigerians Cent. Afr. J. Med. 1992 25 30 38 OLUBUYIDE I.O. 31. ORGANIZACIÓN PANAMERICANA DE LA SALUD. Micotoxinas. Washington, 1983. (Critérios de Salud Ambiental, 11). Micotoxinas 1983 32. OSWEILER, G.D. Mycotoxins and livestock: what role do fungal toxins play in illness and production losses? Vet. Med., 85: 89-94, 1990. Mycotoxins and livestock: what role do fungal toxins play in illness and production losses? Vet. Med. 1990 89 94 85 OSWEILER G.D. 33. OZTURK, M. p53 mutation in hepatocellular carcinoma after aflatoxin exposure. Lancet, 338: 1356-9, 1991. p53 mutation in hepatocellular carcinoma after aflatoxin exposure Lancet 1991 1356 9 338 OZTURK M. 34. PARKIN, D.M.; STJERNSWÄRD, J.; MUIR, C.S. Estimates of the worldwide frequency of twelve major cancers. Bull. World Health Organ., 62: 163-82, 1984. Estimates of the worldwide frequency of twelve major cancers Bull. World Health Organ. 1984 163 82 62 PARKIN D.M. STJERNSWÄRD J. MUIR C.S. 35. PEERS, F.G.; BOSCH, F.X.; KALDOR, J.; LINSELL, A.; PLUIJMEN, M. Aflatoxin exposure, hepatitis B virus infection and liver cancer in Swaziland. Int. J. Cancer, 39: 545-53, 1987. Aflatoxin exposure, hepatitis B virus infection and liver cancer in Swaziland Int. J. Cancer 1987 545 53 39 PEERS F.G. BOSCH F.X. KALDOR J. LINSELL A. PLUIJMEN M. 36. PUISIEUX, A.; LIM, S.; GROOPMAN, J.; OZTURK, M. Selective targeting of p53 gene mutational hotspots in human cancers by etiologically defined carcinogens. Cancer Res., 51: 6185-9, 1991. Selective targeting of p53 gene mutational hotspots in human cancers by etiologically defined carcinogens Cancer Res. 1991 6185 9 51 PUISIEUX A. LIM S. GROOPMAN J. OZTURK M. 37. ROSS, R.K.; YUAN, J.M.; YU, M.C.; WOGAN, G.N.; QUIAN, G.S.; TU, J.T.; GROOPMAN, J.D.; GAO, Y.T.; HENDERSON, B.E. Urinary aflatoxin biomarkers and risk of hepatocellular carcinoma. Lancet, 339: 943-6, 1992. Urinary aflatoxin biomarkers and risk of hepatocellular carcinoma Lancet 1992 943 6 339 ROSS R.K. YUAN J.M. YU M.C. WOGAN G.N. QUIAN G.S. TU J.T. GROOPMAN J.D. GAO Y.T. HENDERSON B.E. 38. SABINO, M.; PRADO, G.; INOMATA, E.I.; PEDROSO, M.O.; GARCIA, R.V. Natural occurence of aflatoxins in maize in Brazil. Part II. Food Addit. Contam., 6: 327-31, 1989. Natural occurence of aflatoxins in maize in Brazil Food Addit. Contam. 1989 327 31 6 SABINO M. PRADO G. INOMATA E.I. PEDROSO M.O. GARCIA R.V. Part II 39. SABINO, M.; ZORZETTO, M.A.; PEDROSO, M.O.; MILANEZ, T.V. Incidęncia de aflatoxinas em amendoim e produtos derivados consumidos na cidade de Săo Paulo, no período de 1980 a 1987. Rev. Inst. Adolfo Lutz, 49: 41-4, 1989. Incidência de aflatoxinas em amendoim e produtos derivados consumidos na cidade de São Paulo, no período de 1980 a 1987 Rev. Inst. Adolfo Lutz 1989 41 4 49 SABINO M. ZORZETTO M.A. PEDROSO M.O. MILANEZ T.V. 40. SELL, S.; HUNT, J.M.; DUNSFORD, H.A.; CHISARI, F.V. Synergy between hepatitis B virus expression and chemical hepatocarcinogens in transgenic mice. Cancer Res., 51: 1278-85, 1991. Synergy between hepatitis B virus expression and chemical hepatocarcinogens in transgenic mice Cancer Res. 1991 1278 85 51 SELL S. HUNT J.M. DUNSFORD H.A. CHISARI F.V. 41. STOLOFF, L. Carcinogenicity of aflatoxins. Science, 237: 1283-4, 1987. Carcinogenicity of aflatoxins Science 1987 1283 4 237 STOLOFF L. 42. VAN RENSBURG, S.J.; COOK-MOZAFFARI, P.; VAN SCHALKWIK, D.J.; VAN DER WATT, J.J.; VINCENT, T.J.; PURCHASE, I.F. Hepatocellular carcinoma and dietary aflatoxin in Mozambique and Transkei. Br. J. Cancer, 51: 713-26, 1985. Hepatocellular carcinoma and dietary aflatoxin in Mozambique and Transkei Br. J. Cancer 1985 713 26 51 VAN RENSBURG S.J. COOK-MOZAFFARI P. VAN SCHALKWIK D.J. VAN DER WATT J.J. VINCENT T.J. PURCHASE I.F. 43. VAN RENSBURG, S.J.; VAN SCHALKWIK, G.C.; VAN SCHALKWIK, D.J. Primary liver cancer and aflatoxin intake in Transkei. J. Environ. Pathol. Toxicol. Oncol., 10: 11-6, 1990. Primary liver cancer and aflatoxin intake in Transkei J. Environ. Pathol. Toxicol. Oncol. 1990 11 6 10 VAN RENSBURG S.J. VAN SCHALKWIK G.C. VAN SCHALKWIK D.J. 44. WILD, C.P.; JIANG, Y.-Z.; ALLEN, S.J.; JANSEN, L.A.M.; HALL, A.J.; MONTESANO, R. Aflatoxin-albumin adducts in sera from different regions of the world. Carcinogenesis, 11: 2271-4, 1990. Aflatoxin-albumin adducts in sera from different regions of the world Carcinogenesis 1990 2271 4 11 WILD C.P. JIANG Y.-Z. ALLEN S.J. JANSEN L.A.M. HALL A.J. MONTESANO R. 45. WILD, C.P.; MONTESANO, R. Correspondence re: T. Colin Campbell e col., Nonassociation of aflatoxin with primary liver cancer in a cross-sectional ecological survey in the Peoples Republic of China. Cancer Res., 51: 3825-7, 1991. Correspondence re: T. Colin Campbell e col., Nonassociation of aflatoxin with primary liver cancer in a cross-sectional ecological survey in the People’s Republic of China Cancer Res. 1991 3825 7 51 WILD C.P. MONTESANO R. 46. WOGAN, G.N. Aflatoxin carcinogenesis: interspecies potency differences and relevance for human risk assessment. Prog. Clin. Biol. Res., 374: 123-37, 1992. Aflatoxin carcinogenesis: interspecies potency differences and relevance for human risk assessment Prog. Clin. Biol. Res. 1992 123 37 374 WOGAN G.N. 47. WORLD HEALTH ORGANIZATION. Principles for the safety assessment of food additives and contaminants in food. Geneva, 1987. (Environmental Health Criteria, 70). Principles for the safety assessment of food additives and contaminants in food 1987 48. YEH, F.S.; YU, M.C.; MO, C.C.; CHI-CHUN; LUO, S.; TONG, M.J.; HENDERSON, B.E. Hepatitis B virus, aflatoxins, and hepatocellular carcinoma in Southern Guangxi, China. Cancer Res., 49: 2506-9, 1989. Hepatitis B virus, aflatoxins, and hepatocellular carcinoma in Southern Guangxi, China Cancer Res. 1989 2506 9 49 YEH F.S. YU M.C. MO C.C. CHI-CHUN LUO S. TONG M.J. HENDERSON B.E.