Avaliação do método de triagem para análise de milho contaminado com aflatoxinas pela fluorescência amarelo-esverdeada brilhante (BGYF- Bright Greenish Yellow Fluorescence)

Evaluation of a screening method of aflatoxin in corn by Bright Greenish Yellow Fluorescence

AVALIAÇÃO DO MÉTODO DE TRIAGEM PARA ANÁLISE DE MILHO CONTAMINADO COM AFLATOXINAS PELA FLUORESCÊNCIA AMARELO-ESVERDEADA BRILHANTE (BGYF- Bright Greenish Yellow Fluorescence)¹

M.E.T. PALOMINO²; H. FONSECA³; E.M. GLÓRIA²; M.A. CALORI-DOMINGUES²; C. MARQUES⁴

²Pós-Graduanda em Ciência e Tecnologia de Alimentos da ESALQ/USP.

³Depto. de Ciência e Tecnologia Agroindustrial-ESALQ/USP, C.P. 9, CEP: 13418-900 - Piracicaba, SP.

⁴Bolsista do CNPq.

RESUMO: A técnica da fluorescência amarelo-esverdeada brilhante (BGYF) como método de triagem na avaliação de milho eventualmente contaminado com aflatoxina, utilizada por uma indústria alimentícia do Estado de São Paulo em 61 amostras de milho, foi comparada com a técnica BGYF padronizada, aplicada em laboratório antes e após trituração dos grãos e, também, com a técnica da cromatografia em camada delgada (CCD). Os resultados da indústria geraram menor número de resultados falso-positivos do que a técnica BGYF padronizada. Por outro lado, apenas os resultados da indústria apresentaram amostras falso-negativas, ao contrário da BGYF padronizada, que não as apresentou. Conclui-se que existe uma inadequação do número de pontos fluorescentes adotados como critério de rejeição em ambas as técnicas, devendo-se proceder estudos, com maior número de amostras, para determinar o número adequado de pontos fluorescentes a ser adotado como critério além de outros fatores que possam influenciar a metodologia.

Descritores: aflatoxina, milho, fluorescência BGY, triagem

EVALUATION OF THE SCREENING METHOD OF AFLATOXIN IN CORN BY BRIGHT GREENISH YELLOW FLUORESCENCE

ABSTRACT: The bright greenish yellow fluorescence technique (BGYF) is a screening method for the evaluation of corn occasionally contaminated by aflatoxins, used by an industry of the State of São Paulo on sixty one samples, was compared with laboratory results of the BGYF standard technique, before and after crushing the grains, and also with thin layer chromatographic analysis. The industry showed results with a smaller number of false positives than the BGYF standard technique. However, the industry showed false negative results and the BGYF standard technique did not. It was concluded that the number of fluorescent points adopted, as a rejection criterion, in both techniques, was inadequate and studies should be developed with more samples to determine the adequate number of fluorescent points to be adopted as a rejection criterion and the influence of other factors.

Key Words: aflatoxin, corn, BGYF, screening

INTRODUÇÃO

Atualmente, a nível mundial, o milho ocupa o terceiro lugar entre os cereais, em área plantada e em produção, perdendo apenas para o trigo e o arroz. Devido ao seu alto teor de carboidratos, principalmente amido, e de outros componentes, como proteínas, óleos e vitaminas, constitui-se em inestimável matéria-prima para expressiva série de produtos industrializados (Fancelli, 1983).

O grão de milho é susceptível à contaminação por diversos fungos como Aspergillus flavus Link ex Fries e Aspergillus parasiticus Speare, os quais são produtores de aflatoxinas (Heathcote, 1984), que são conhecidas por sua ação mutagênica, carcinogênica, teratogênica no ser humano e em vários animais (Bradburn et al., 1993).

A literatura descreve inúmeros métodos para a detecção de aflatoxinas em alimentos e produtos agrícolas, porém, nas indústrias, a aplicabilidade restringe-se aos que possibilitam a avaliação rápida do material, uma vez que a decisão de aceite ou rejeição do lote de milho é imprescindível já no recebimento da matéria-prima.

Marsh et al. (1955) observaram a formação de fluorescência amarelo esverdeada brilhante ("bright greenish yellow" - BGY) em fibras de algodão, contaminadas com A. flavus, quando submetidas a luz ultravioleta (365 nm). Desse modo, os autores sugeriram que a fluorescência amarelo esverdeada brilhante (BGYF) da fibra poderia ser empregada como um teste promissor para localizar sementes de algodão contendo A. flavus.

Shotwell et al. (1972) observaram também a mesma fluorescência em grãos de milho danificados, que continham 85.000 a 101.000 g/kg de aflatoxina B₁, grãos de milho que apresentaram fluorescência branca ou azul não possuíam aflatoxina B₁ e a fluorescência BGY desaparecia quando a aflatoxina B₁ era extraída dos grãos.

A triagem de aflatoxinas em milho, através da fluorescência amarelo esverdeada brilhante, é um dos métodos mais utilizados pelas indústrias de alimentos e rações no Brasil. Entretanto, as modificações arbitrárias realizadas na técnica BGYF, resultante da alteração na quantidade a ser visualizada, tais como, não trituração do milho e número de pontos fluorescentes considerados como critério de rejeição, podem afetar a sua eficiência.

O objetivo deste trabalho foi avaliar a eficiência da técnica de detecção de aflatoxina através da visualização de pontos fluorescentes no milho, do modo como é utilizada por uma indústria alimentícia do Estado de São Paulo, através de comparações desta técnica com os procedimentos originalmente recomendados e com a cromatografia em camada delgada (CCD).

MATERIAL E MÉTODOS

Neste trabalho foram utilizadas amostras de milho retiradas de cargas que chegaram a uma indústria alimentícia do Estado de São Paulo que utiliza a técnica BGYF como rotina.

A Figura 1 mostra o fluxograma da metodologia utilizada para avaliação da eficiência da técnica de fluorescência BGY utilizada pela indústria.

Figura 1
- Fluxograma da metodologia utilizada para avaliação da eficiência da técnica de fluorescência BGY da indústria.

Três amostragens foram efetuadas no período de um ano, retirando-se 20, 20 e 21 amostras na primeira, segunda e terceira amostragens, respectivamente. Cada amostra constituiu-se de 6 a 9 sub-amostras, retiradas de diferentes pontos da carga, reunidas e misturadas formando um volume final de aproximadamente 5kg.

A mesma amostra, analisada segundo a técnica BGYF empregada pela indústria, foi encaminhada para o Laboratório de Micotoxinas da ESALQ/USP, afim de submeter-se à técnica BGYF padronizada e a análise de CCD.

Técnica BGYF empregada pela indústria: A indústria em questão efetuou a triagem da contaminação com aflatoxinas visualizando em cabine de Barabolak et al. (1978) uma amostra de 4,5kg, não triturada e adotando uma critério de rejeição da presença de 7 ou mais pontos fluorescentes.

Técnica BGYF Padronizada: A técnica BGYF padronizada consiste de uma amostra de 4,5kg de grãos de milho, observada através da cabine desenvolvida por Barabolak et al. (1978), sem proceder a quebra dos grãos (Shotwell & Hesseltine, 1981). As amostras contendo um ou mais pontos fluorescentes foram consideradas positivas para a técnica BGYF padronizada, ou seja, seriam amostras contaminadas.

De acordo com Wyatt (1988), as amostras com um ou mais pontos fluorescentes têm alta probabilidade de conter aflatoxina B₁, em nível superior a 20mg/kg e, por isto devem ser analisadas posteriormente por outra metodologia analítica para confirmação da presença da toxina.

Técnica BGYF padronizada empregada em amostra triturada: Trabalhos anteriores ao de Shotwell & Hesseltine (1981), como por exemplo Shotwell et al. (1974) recomendavam a trituração antes de submeter-se à luz ultravioleta devido à possibilidade da fluorescência estar presente sob o pericarpo do grão. Assim, com o objetivo de se analisar a influência da trituração, uma segunda visualização da amostra foi feita após a trituração das mesmas. Para isto, as amostras foram trituradas em um moinho de disco e subdivididas através de uma peneira de 9 "mesh" (diámetro, 2mm), obtendo-se duas frações: grãos quebrados, constituída pelo material retido na peneira, e o farelo que foi o material peneirado. Em seguida as duas frações foram submetidas à luz ultravioleta para detectar os pontos fluorescentes.

Cromatografia em Camada Delgada (CCD): Com o objetivo de se avaliar a contaminação ou não com aflatoxinas, o material triturado já visualizado foi totalmente moído, até granulação de 20 "mesh" (diâmetro, 0,84mm) e em seguida usou-se o método de Soares & Rodrigues-Amaya (1989) para extração, sendo a detecção e quantificação das aflatoxinas feita através da comparação visual da intensidade da fluorescência da amostra e do padrão quantitativo, por cromatografia de camada delgada bidirecional.

Avaliação dos resultados: Os resultados da técnica BGYF, aplicada pela indústria e os resultados da técnica BGYF padronizada, testada em laboratório, foram comparados com a análise em CCD.

Com a finalidade de se avaliar os resultados considerou-se que as amostras com resultados através do método em CCD, menor do que 20mg/kg, eram amostras não contaminadas, por estarem abaixo do limite máximo estabelecido pela legislação brasileira que é de 20mg/kg, para somatória das aflatoxinas B₁, B₂, G₁ e G₂ (Brasil, 1996) e as que apresentaram contaminação acima ou igual a esse valor foram consideradas amostras contaminadas.

Assim, amostras que foram positivas para as técnicas BGYF e que apresentaram contaminação menor do que 20mg/kg foram consideradas amostras falso-positivas e as amostras que foram negativas para as técnicas BGYF e que apresentaram contaminação maior que 20mg/kg, foram consideradas amostras falso-negativas.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Amostras falso-positivas: A ocorrência de amostras falso-positivas pelas diferentes técnicas BGYF é apresentada na TABELA 1.

A técnica BGYF, utilizada pela indústria, apresentou somente 1 resultado falso-positivo. Entretanto, a técnica BGYF utilizada em nosso laboratório, na visualização da amostra sem e com trituração, gerou um número muito maior de falso-positivos.

Isto pode ter ocorrido devido principalmente ao número de pontos adotado como critério de rejeição como pode ser visto nas TABELAS 2 e 3.

Tanto antes como após a trituração dos grãos, 23 e 22 amostras, respectivamente, apresentaram de 1 a 4 pontos detectados e dentre estas amostras somente 1 (4,3%), detectada antes da trituração, apresentou nível de contaminação mais elevado do que 20mg/kg. Entretanto, já dentre as amostras com 5 ou mais pontos fluorescentes detectados, que foram 4 antes e 8 após a trituração, o número de amostras com contaminação >20mg/kg foi de 4 (100%) e 5 (62,5%), respectivamente.

Portanto, a eficiência do método, no sentido de gerar resultados falso-positivos, foi bastante afetada pelo critério adotado.

A diminuição do número de resultados falso-positivos deve ser um dos objetivos da técnica BGYF, a fim de que ela se torne mais exata e, portanto, provoque menor dispêndio econômico com a análise posterior desnecessária de amostras rejeitadas.

A visualização da fração farelo, obtida após trituração, gerou um número relativamente menor de falso-positivos do que as outras técnicas testadas em laboratório; entretanto, isto deve ter acontecido em função da dificuldade de visualização de pontos fluorescentes no farelo, devido à pequena granulometria das partículas.

Amostras falso-negativas: A ocorrência de resultados falso-negativos é preocupante, porque permite que amostras contaminadas com níveis acima de 20mg/kg de aflatoxina, sejam aceitas pela indústria. Glória et al. (1998), investigando 286 amostras de milho, aprovadas pela técnica BGYF de uma indústria, observaram, pela análise físico-química destas, a ocorrência de 14 amostras com contaminação acima de 20mg/kg, ou seja, 14 amostras falso-negativas.

O número de resultados falso-negativos gerados neste estudo pela técnica BGYF aplicada na indústria e em laboratório, é mostrada na TABELA 1.

Somente a técnica BGYF realizada pela indústria gerou resultados falso-negativos.

A aplicação da técnica BGYF padronizada, por ser efetuada com mais atenção e adotar um critério de rejeição rigoroso (>1 ponto), diminuiu a possibilidade de ocorrência de resultados falso-negativos.

Por outro lado, os resultados falso-negativos da indústria podem ter ocorrido devido a uma falha de visualização do observador da indústria uma vez que as amostras não apresentaram pontos fluorescentes na visualização da indústria e apresentaram 1 e 5 pontos na visualização em laboratório antes da trituração.

Na utilização da técnica BGYF deve-se procurar atingir o máximo de exatidão possível na detecção de pontos fluorescentes e deve-se adotar um critério de rejeição adequado, a fim de evitar a ocorrência de resultados falso-negativos e o mínimo de resultados falso-positivos. Para este trabalho, com o número de amostras investigadas, o número de 5 pontos fluorescentes como critério de rejeição, seria o mais adequado para atingir este objetivo uma vez que, somente um resultado continuaria a ser falso-negativo e o número de falso-positivos não aumentaria.

Contudo, para uma melhor avaliação do critério a ser utilizado, um maior número de amostras deve ser considerado em estudos posteriores.

CONCLUSÕES

- Os resultados gerados pela aplicação da técnica BGYF pela indústria foram os que mostraram menor número de resultados falso-positivos.

- A técnica BGYF padronizada mostrou um número muito grande de falso-positivos.

- Os resultados da indústria foram os únicos que apresentaram falso- negativos, ao contrário da técnica BGYF padronizada que não os apresentaram.

- Existe uma inadequação do número de pontos fluorescentes adotados como critério de rejeição de lotes na técnica da indústria e da padronizada.

- Pelos resultados obtidos, preliminarmente, o melhor critério de rejeição a ser adotado pela indústria seria de 5 pontos fluorescentes, proporcionando assim uma diminuição no número de falso-negativos sem aumentar os falso-positivos, embora melhores estudos ainda sejam necessários com maior número de amostras para determinar o número adequado de pontos fluorescentes.

Recebido para publicação em 05.08.97

Aceito para publicação em 05.05.98

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¹

Parte da dissertação de mestrado do primeiro autor apresentada à ESALQ.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  14 Maio 1999
• Data do Fascículo
  1998

Histórico

• Aceito
  05 Ago 1998
• Recebido
  05 Ago 1997