Efeito Anti-Hipertensivo de Novos Agonistas do Receptor de Adenosina em Ratos Espontaneamente Hipertensos

Resumo

Fundamento

A hipertensão arterial sistêmica é um fator de risco para disfunções cardíacas, renais e metabólicas. A busca por novas estratégias para prevenir e tratar doenças cardiovasculares levou à síntese de novas N-acilidrazonas para produzir efeito anti-hipertensivo. Os receptores de adenosina são um alvo alternativo para reduzir a pressão arterial devido à sua ação vasodilatadora e propriedades antioxidantes, que podem reduzir o estresse oxidativo característico da hipertensão arterial sistêmica.

Objetivo

Avaliar o perfil anti-hipertensivo de novos compostos contendo selênio desenvolvidos para melhorar sua interação com os receptores de adenosina.

Métodos

Foi avaliada a reatividade vascular, registrando-se a tensão isométrica da aorta torácica pré-contraída de ratos Wistar machos após exposição a concentrações crescentes de cada derivado (0,1 a 100 μM). Para investigar o efeito anti-hipertensivo em ratos espontaneamente hipertensos, foram determinadas a pressão arterial sistólica, pressão arterial diastólica, pressão arterial média e a frequência cardíaca após administração intravenosa de 10 e 30 μmol/kg do composto selecionado LASSBio-2062.

Resultados

Os compostos denominados LASSBio-2062, LASSBio-2063, LASSBio-2075, LASSBio-2076, LASSBio-2084, LASSBio-430, LASSBio-2092 e LASSBio-2093 promoveram vasodilatação com concentrações efetivas médias de 15,5 ± 6,5; 14,6 ± 2,9; 18,7 ± 9,6; 6,7 ± 4,1; > 100; 6,0 ± 3,6; 37,8 ± 11,8; e 15,9 ± 5,7 μM, respectivamente. O LASSBio-2062 (30 μmol/kg) reduziu a pressão arterial média em ratos espontaneamente hipertensos de 124,6 ± 8,6 para 72,0 ± 12,3 mmHg (p < 0,05). A ativação do receptor de adenosina subtipo A₃ e dos canais de potássio parece estar envolvida no efeito anti-hipertensivo do LASSBio-2062.

Conclusões

O novo agonista do receptor de adenosina e ativador dos canais de potássio é um potencial agente terapêutico para o tratamento da hipertensão arterial sistêmica.

Palabras clave:
Hipertensão; Vasodilatação; Canais de Cálcio; Receptores Purinérgicos P1

Abstract

Background

Systemic arterial hypertension is a risk factor for cardiac, renal, and metabolic dysfunction. The search for new strategies to prevent and treat cardiovascular diseases led to the synthesis of new N-acylhydrazones to produce antihypertensive effect. Adenosine receptors are an alternative target to reduce blood pressure because of their vasodilatory action and antioxidant properties, which may reduce oxidative stress characteristic of systemic arterial hypertension.

Objective

To evaluate the antihypertensive profile of novel selenium-containing compounds designed to improve their interaction with adenosine receptors.

Methods

Vascular reactivity was evaluated by recording the isometric tension of pre-contracted thoracic aorta of male Wistar rats after exposure to increasing concentrations of each derivative (0.1 to 100 μM). To investigate the antihypertensive effect in spontaneously hypertensive rats, systolic, diastolic, and mean arterial pressure and heart rate were determined after intravenous administration of 10 and 30 μmol/kg of the selected compound LASSBio-2062.

Results

Compounds named LASSBio-2062, LASSBio-2063, LASSBio-2075, LASSBio-2076, LASSBio-2084, LASSBio-430, LASSBio-2092, and LASSBio-2093 promoted vasodilation with mean effective concentrations of 15.5 ± 6.5; 14.6 ± 2.9; 18.7 ± 9.6; 6.7 ± 4.1; > 100; 6.0 ± 3.6; 37.8 ± 11.8; and 15.9 ± 5.7 μM, respectively. LASSBio-2062 (30 μmol/kg) reduced mean arterial pressure in spontaneously hypertensive rats from 124.6 ± 8.6 to 72.0 ± 12.3 mmHg (p < 0.05). Activation of adenosine receptor subtype A₃ and potassium channels seem to be involved in the antihypertensive effect of LASSBio-2062.

Conclusions

The new agonist of adenosine receptor and activator of potassium channels is a potential therapeutic agent to treat systemic arterial hypertension.

Keywords:
Hypertension; Vasodilation; Calcium Channels; Purinergic P1 Receptors

Introdução

Segundo estimativas da Organização Mundial da Saúde, a morte de aproximadamente 23,6 milhões de pessoas ocorrerá até 2030 em decorrência de doenças cardiovasculares.¹ Mesmo com a grande variedade de tratamentos existentes, a hipertensão arterial continua a ser a principal causa de morte cardíaca em todo o mundo, sendo responsável por 10,4 milhões de mortes por ano, com o maior número de indivíduos afetados pela hipertensão em países de baixa e média renda.²-⁵

Embora existam diversas terapias modernas para o tratamento da hipertensão, ela continua sendo a principal causa de doenças cardiovasculares, como cardiopatia isquêmica, insuficiência cardíaca e acidente vascular cerebral, agravadas pelo envelhecimento populacional.⁶-⁹

Devido ao caráter assintomático, a hipertensão arterial sistêmica pode evoluir com alterações estruturais e/ou funcionais em órgãos-alvo (coração, cérebro, rins e vasos).¹⁰ É importante buscar novas estratégias para a prevenção e o tratamento da hipertensão; dessa maneira, foram projetadas novas N-acilidrazonas, sintetizadas a partir da 3,4-metilenodioxibenzoil-2-tienilhidrazona (LASSBio-294) para testar a atividade vasodilatadora. O LASSBio-294, caracterizado como agente inotrópico cardíaco positivo com atividade vasodilatadora, preveniu a disfunção cardíaca induzida por infarto do miocárdio em ratos normotensos e hipertensos, possivelmente devido à ativação de receptores de adenosina A_2A.¹¹-¹⁶ Para melhorar a interação entre a molécula e seu sítio de ação, os novos compostos possuem o átomo de enxofre (–S) em vez de selênio (–Se), o que confere uma conformação restrita, levando a uma melhor interação composto-receptor¹⁷ e, consequentemente, aumentando a potência vasodilatadora. Algumas alterações na estrutura molecular poderiam gerar compostos com mecanismos de ação multialvos, favorecendo a adesão dos pacientes à terapia, uma vez que a polifarmácia é comum para o controle da hipertensão arterial na maioria dos pacientes.¹⁸ A busca por novas terapias para hipertensão é uma tentativa de aumentar a adesão dos pacientes ao tratamento, pois este é um grande desafio para os cardiologistas, devido ao uso de múltiplos medicamentos e/ou administrações, alta incidência de efeitos adversos e doença primária não diagnosticada.¹⁹, ²⁰

O principal objetivo deste estudo foi identificar uma nova N-acilidrazona, na qual a substituição do átomo de enxofre pelo selênio pudesse aumentar a atividade vasodilatadora e produzir um efeito anti-hipertensivo. Com base nos resultados, foi selecionado o LASSBio-2062, que foi um vasodilatador potente através da ativação dos receptores de adenosina A₃ e dos canais K. O LASSBio-2062 poderia ser uma nova abordagem à monoterapia para hipertensão, uma vez que promoveu a normalização da pressão arterial em ratos espontaneamente hipertensos (SHR).

Métodos

Os experimentos estavam de acordo com o Comitê de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal do Rio de Janeiro (017/19). Os animais incluídos neste estudo foram divididos aleatoriamente, com base no peso e/ou idade. Cinco ratos Wistar machos (220 a 250 g) ou quatro SHR machos (12 a 15 semanas e 220 a 250 g) foram utilizados para cada protocolo conduzido em experimentos in vitro e in vivo, respectivamente. Os SHR foram tratados com injeção intravenosa de dose única de LASSBio-2062 e foram eutanasiados com administração intraperitoneal (IP) de tiopental (120 mg/kg) imediatamente após a medição da pressão arterial.²¹ Todos os animais foram mantidos sob controle de temperatura e ciclo claro/escuro de 12 horas, com acesso a água e alimentos ad libitum.

Compostos

Os derivados (Figura 1) foram sintetizados e fornecidos pelo Laboratório de Avaliação e Síntese de Substâncias Bioativas (LASSBio^®) da Universidade Federal do Rio de Janeiro. O protótipo, 3,4-metilenodioxibenzoil-2-tienilhidrazona e seus análogos foram denominados LASSBio-294, LASSBio-2062, LASSBio-2063, LASSBio-430, LASSBio-2075, LASSBio-2084, LASSBio-2076, LASSBio-2092 e LASSBio-2093.

Figura 1
(A) Estrutura química do LASSBio-294. (B) Estrutura indicando os pontos de mudança na molécula que originou os seguintes análogos: X = S ou Se; R1 = -OCH₂O- ou -3,4-OCH₃ ou -3-OCH₃ ou -4-OCH₃ e R2 = -H ou -CH₃.

Experimentos in vitro

Reatividade vascular

A aorta torácica de ratos Wistar machos foi removida e cortada em anéis de 2 a 3 mm, os quais foram posicionados em câmaras experimentais contendo 20 mL de solução de Tyrode modificada composta por (em mM): 123 NaCl; 4,7 KCl; 15,5 NaHCO₃; 1,2 CaCl₂; 1,2 KH₂PO₄; 1,2 MgCl₂; e 11,5 glicose. Foram oxigenados com mistura de carbogênio a 37 °C e pH 7,4. Após 2 horas de equilíbrio e sob 1 g de tensão inicial, os anéis aórticos foram inicialmente expostos a 10 μM de fenilefrina para promover a contração máxima registrada por meio de um transdutor de força (MLT884, ADInstruments, Austrália), conectado a um sistema de aquisição (Powerlab, ADInstruments, Austrália), utilizando o programa Lab Chart (versão 7.0, ADInstruments, Austrália). Os anéis pré-contraídos foram expostos a 10 μM de acetilcolina para promover relaxamento que, quando igual ou superior a 80%, determinou a presença de endotélio intacto. Em contrapartida, quando os anéis aórticos submetidos à remoção mecânica do endotélio produziram menos de 10% de relaxamento, houve falta de endotélio funcional. Concentrações crescentes (0,1 a 100 μM) de todos os análogos (LASSBio-2062, LASSBio-2063, LASSBio-430, LASSBio-2075, LASSBio-2084, LASSBio-2076, LASSBio-2092, LASSBio-2093) foram adicionadas às câmaras contendo os anéis aórticos contraídos com fenilefrina para obter as curvas de concentração-resposta de relaxamento.²²

Investigamos os mecanismos envolvidos no relaxamento vascular induzido pelo composto selecionado, LASSBio-2062, com pré-exposição de anéis aórticos com endotélio intacto a um antagonista do receptor de adenosina A_2A, ZM-241385 (0,1 μM). Anéis aórticos sem endotélio foram pré-incubados com um dos seguintes: um antagonista do receptor de adenosina A₃ (MRE 3008F20, 0,1 μM); um antagonista dos canais de potássio sensível a ATP (glibenclamida, 10 μM); um bloqueador do canal de potássio voltagem-dependente (4-aminopiridina, 3 mM); ou um bloqueador do canal de potássio cálcio-dependente de alta condutância (cloreto de tetraetilamônio, 3 mM).

Experimentos in vivo

Medição da pressão arterial

Os SHR sob anestesia com cetamina (80 mg/kg, IP) e xilazina (15 mg/kg, IP) foram submetidos ao cateterismo, utilizando um cateter preenchido com solução salina e heparina, conectado a um transdutor de pressão (MLT884, ADInstruments, Austrália). Esse procedimento possibilitou o registro das pressões arteriais sistólica e diastólica e da frequência cardíaca durante a injeção intravenosa de LASSBio-2062 (10 e 30 μmol/kg) pela veia jugular esquerda. Os parâmetros foram obtidos utilizando um sistema de aquisição (Powerlab, ADInstruments, Austrália) e o software Lab Chart (versão 7.0, ADInstruments, Austrália).

Análise estatística

Os dados são expressos como média ± erro padrão da média. Para cada substância testada, calculamos a concentração que causou metade do efeito máximo de relaxamento (EC₅₀). Foi utilizada a análise ANOVA bidirecional seguida de pós-teste de Tukey para avaliar dados de experimentos in vitro. Foi realizada a análise pelo teste t de Student em dados de experimentos in vivo. A diferença entre os grupos experimentais foi considerada estatisticamente significativa quando p < 0,05. Foram considerados poder estatístico (β) de 80% e taxa de falsos positivos (α) de 5%. Para identificar alterações com poder estatístico (β) de 80% e taxa de falsos positivos (α) de 5%, foi necessário um número experimental de 5 animais para o protocolo in vitro. Dessa maneira, o teste estatístico diferencia as respostas com variação de pelo menos 15% e desvio padrão médio de 8,0%, em percentuais relativos à média do grupo controle. Quanto aos protocolos in vivo, o desvio padrão médio foi de 7,0% em relação ao grupo controle, com número experimental de 4 animais para cada grupo. Foi utilizado o software http://powerandsamplesize.com/Calculators para calcular o tamanho da amostra.

Resultados

Reatividade vascular em anéis aórticos com ou sem endotélio intacto

As N-acilidrazonas foram avaliadas quanto ao potencial de produzir vasodilatação em comparação ao protótipo (LASSBio-294). Cada derivado foi testado em anéis aórticos com e sem endotélio intacto, que foram expostos a concentrações crescentes (0,1 a 100 μM). A Tabela 1 inclui os valores de EC₅₀ nos anéis aórticos. As curvas de concentração-relaxamento vascular para todos os análogos testados são exibidas na Figura 2. A remoção mecânica do endotélio aumentou a EC₅₀ de 15,5 ± 6,5 para 49,4 ± 10,0 μM para o LASSBio-2062, indicando que o seu efeito é parcialmente dependente da integridade funcional do endotélio vascular (Figura 2A). Os valores de EC₅₀ para o LASSBio-2063 foram 14,6 ± 2,9 e 22,8 ± 8,0 μM em anéis com e sem endotélio, respectivamente, sugerindo que não depende da integridade endotelial (Figura 2B).

Tabela 1
EC₅₀ de análogos para relaxamento vascular em anéis aórticos de ratos

Composto	R1	R2	X	EC50 (µM) (com endotélio)	EC50 (µM) (sem endotélio)
LASSBio-294	-OCH2O-	H	S	65,4 ± 30,0	> 100*
LASSBio-2062	-OCH2O-	H	Se	15,5 ± 6,5	49,4 ± 10,0*
LASSBio-785	-OCH2O-	CH3	S	10,2 ± 0,5	18,5 ± 3,6
LASSBio-2063	-OCH2O-	CH3	Se	14,6 ± 2,9	22,8 ± 8,0
LASSBio-430	3,4-OCH3	H	S	6,0 ± 3,6	14,1 ± 2,8
LASSBio-2075	3,4-OCH3	H	Se	18,7 ± 9,6	> 100*
LASSBio-2084	4-OCH3	H	S	> 100	> 100
LASSBio-2076	4-OCH3	H	Se	6,7 ± 4,1	60,1 ± 20,2*
LASSBio-2092	3-OCH3	H	S	37,8 ± 11,8	59,8 ± 11,9
LASSBio-2093	3-OCH3	H	Se	15,9 ± 5,7	> 100*

• ^*
  ₅₀₁₂

Figura 2
Curvas de concentração-resposta vascular para (A) LASSBio-294; (B) LASSBio-2062; (C) LASSBio-2063; (D) LASSBio-2084; (E) LASSBio-2076;(F) LASSBio-430; (G) LASSBio-2075; (H) LASSBio-2092; e (I) LASSBio-2093 em anéis aórticos com ou sem endotélio funcional. Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média. *p < 0,05 comparado ao endotélio intacto. Análise por ANOVA bidirecional seguida de pós-teste de Tukey.

O design e a síntese do LASSBio-430 basearam-se na abertura do anel 1,3-benzodioxol, cujos resultados indicam que essa alteração estrutural pode levar ao aumento da eficácia e da potência da vasodilatação, com relaxamento máximo independente do endotélio de 99,2% ± 0,8 % e EC₅₀ de 6,0 ± 3,6 μM.

Em contrapartida, o LASSBio-2075, que possui presença adicional do anel selenofênico no lugar do anel tiofênico, possui EC₅₀ de 18,7 ± 9,6 e o relaxamento vascular é dependente da integridade do endotélio, porque o valor passou a ser > 100 μM quando o endotélio foi removido. O LASSBio-2084 não apresentou melhora na potência indicando que a metoxilação não interfere na reatividade vascular. Da mesma forma, o relaxamento vascular induzido pelo LASSBio-2093 foi dependente da integridade do endotélio, uma vez que a EC₅₀ aumentou de 15,9 ± 5,7 para > 100 μM.

A dependência da integridade vascular para a ação vasodilatadora do LASSBio-2076 foi confirmada pelo aumento da EC₅₀ de 6,7 ± 4,1 para 60,1 ± 20,2 μM. Assim, a metoxilação somada à presença do anel selenofênico promoveu um aumento na potência do LASSBio-2076 em anéis aórticos com endotélio íntegro. O análogo LASSBio-2092 apresentou valores de EC₅₀ de 37,8 ± 11,8 e 59,8 ± 11,9 μM em anéis aórticos com e sem endotélio, respectivamente.

O LASSBio-2062 foi selecionado para investigação dos mecanismos envolvidos no relaxamento vascular, devido à grande semelhança estrutural com o composto original.

Investigação dos mecanismos envolvidos na ação vasodilatadora do LASSBio-2062

Via do receptor de adenosina

Não houve alteração no relaxamento vascular promovido pelo LASSBio-2062 na presença de um antagonista do receptor de adenosina A_2A, ZM-241385 (Figura 3A). Porém, quando os anéis aórticos foram pré-incubados com o antagonista do receptor de adenosina A₃, MRE 3008F20, a curva de concentração-resposta apresentou desvio para a direita (Figura 3B). Além disso, o relaxamento máximo induzido pelo LASSBio-2062 alterou de 72,1% ± 4,0% para 23,6% ± 7,7% na presença do MRE 3008F20. Esses dados indicam que o composto promove vasodilatação pela ativação do receptor de adenosina tipo A₃, mas não do receptor de adenosina tipo A_2A.

Figura 3
Curvas concentração-relaxamento vascular do LASSBio-2062 em anéis aórticos com endotélio: (A) na ausência ou presença de ZM-241385 (0,1 μM), antagonista do receptor A2A da adenosina; e (B) na presença de MRE 3008F20 (0,1 μM), um antagonista do receptor A3 de adenosina. Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média. *p < 0,05 comparado ao endotélio intacto. Análise por ANOVA dois fatores seguida de pós-teste de Tukey.

Envolvimento de canais de potássio

Quando os anéis aórticos foram pré-incubados com glibenclamida (10 μM), que é um bloqueador do canal de potássio sensível a ATP, a resposta de concentrações crescentes de LASSBio-2062 foi alterada (Figura 4A). Quando na presença de 4-aminopiridina (Figura 4B) ou cloreto de tetraetilamônio (Figura 4C), a curva concentração-relaxamento do LASSio-2062 se deslocou para a direita, indicando que a vasodilatação induzida pelo LASSBio-2062 pode ser consequente à ativação do canal de potássio sensível a ATP, do canal de potássio voltagem-dependente e do canal de potássio cálcio-dependente (Figura 4).

Figura 4
Curvas de concentração-relaxamento vascular do LASSBio-2062 em anéis aórticos sem endotélio na ausência ou presença de: (A) glibenclamida (10 μM), um bloqueador do canal de potássio sensível a ATP; (B) 4-aminopiridina (4-AP, 3 mM), um bloqueador do canal de potássio voltagem- dependente; e (C) cloreto de tetraetilamônio (TEA, 3 mM), um bloqueador do canal de potássio cálcio-dependente de alta condutância. Os dados são expressos como média ± erro padrão da média. *p < 0,05 comparado ao controle. Análise por ANOVA bidirecional seguida de pós-teste de Tukey.

Influência do influxo de cálcio na ação das N-acilidrazonas

Para verificar se o LASSBio-2062 induzia vasodilatação através de uma interferência adicional na concentração intracelular de Ca²⁺, anéis aórticos sem endotélio foram expostos a concentrações crescentes de CaCl₂ (1 a 1000 µM), na ausência ou presença do análogo (50 μM) (Figura 5). A curva concentração-resposta se deslocou para a direita com a exposição ao LASSBio-2062, com aumento da EC₅₀ de 157,6 ± 51,3 para 420,0 ± 11,0 μM (p < 0,05).

Figura 5
Curvas de concentração-resposta de CaCl₂ na ausência ou presença do LASSBio-2062 em anéis aórticos sem endotélio. Os dados são expressos como média ± erro padrão da média. *p < 0,05 comparado ao controle. Análise por ANOVA bidirecional seguida de pós-teste de Tukey.

Efeito anti-hipertensivo do LASSBio-2062

Após administração intravenosa do LASSBio-2062, a pressão sistólica dos SHR reduziu de 155,1 ± 10,1 para 110,6 ± 8,0 e de 151,1 ± 10,0 para 109,4 ± 13,8 mmHg nas doses de 10 e 30 μmol/kg, respectivamente. A pressão diastólica também foi reduzida com a administração de LASSBio-2062 de 111,0 ± 9,1 para 63,9 ± 14,7 (10 μmol/kg) e de 100,2 ± 7,8 para 54,0 ± 10,4 mmHg (30 μmol/kg). A pressão arterial média diminuiu de 132,0 ± 9,2 e 124,6 ± 8,6 mmHg (grupo controle) para 82,1 ± 12,6 (p < 0,05) e 72,0 ± 12,3 mmHg (p < 0,05) após injeção intravenosa de 10 e 30 µmol/kg de LASSBio-2062 nos SHR. A frequência cardíaca alterou-se de 248,1 ± 12,1 para 146,5 ± 21,0 e de 228,4 ± 11,3 para 109,8 ± 21,4 bpm com doses diferentes de LASSBio-2062 (Figura 6).

Figura 6
Parâmetros hemodinâmicos observados em ratos espontaneamente hipertensos antes (controle) e após administração intravenosa de LASSBio-2062. (A) Pressão sistólica; (B) pressão diastólica; (C) pressão média; e (D) frequência cardíaca, medidas antes e após a administração de 10 μmol/kg (n = 4) e 30 μmol/kg (n = 4) de LASSBio-2062. Os dados são expressos como média ± erro padrão da média. *p < 0,05 versus controle. Análise pelo teste t de Student.

Discussão

A semelhança nas propriedades químicas do enxofre e do selênio incentivou o design, a síntese e a avaliação comparativa de uma ampla variedade de moléculas contendo selênio. Porém, existem diferenças nas propriedades físico-químicas entre substâncias que contêm enxofre ou selênio em suas estruturas, que constituem a base para a promoção de efeitos biológicos específicos. Entre as diversas funções biológicas promovidas pelo selênio, tem sido descrita a ação antioxidante.²³

As novas N-acilidrazonas testadas visaram identificar novos agentes anti-hipertensivos que pudessem, além de reduzir a pressão arterial, interferir no estresse oxidativo, que é uma condição comum na hipertensão arterial. A comparação entre os compostos demonstrou aumento da potência do relaxamento vascular independente do endotélio induzido pelo LASSBio-2062, que teve substituição do anel tiofênico pelo anel selenofênico. A N-metilação observada no LASSBio-2063 proporcionou não somente o aumento da potência da ação vasodilatadora, mas também a independência da integridade do endotélio vascular, semelhantemente ao observado para o LASSBio-785, que apresenta N-metilação em seu estrutura, mas com átomo de enxofre.²⁴ A N-metilação parece estar envolvida com o aumento da potência, possivelmente porque o grupo metil, ligado à ligação amida da N-acilidrazona, é capaz de induzir alteração na conformação da estrutura molecular da substância. Assim, a avaliação desses novos derivados reafirma que as modificações estruturais introduzidas pelo grupo metil são essenciais tanto para o aumento da eficácia e da potência vasodilatadora quanto para alterações nas vias envolvidas para o efeito vascular.²⁴ A abertura do anel benzodioxol, além da substituição do átomo de enxofre pelo selênio (LASSBio-2075) resultou em relaxamento vascular dependente da integridade endotelial, diferentemente do LASSBio-430, que possui um átomo de enxofre em sua estrutura.

Dentre todos os derivados testados, apenas o LASSBio-2084 não apresentou melhora na potência em comparação ao protótipo LASSBio-294, indicando que a para-metoxilação reduziu tanto a potência quanto a eficácia da substância para relaxamento vascular, características revertidas pela presença do átomo de selênio (LASSBio-2076). Os derivados metoxilados na meta-posição contendo átomo de enxofre (LASSBio-2092) ou selênio (LASSBio-2093) não apresentaram alteração significativa da potência.

A substituição do anel tiofênico pelo anel selenofênico proporcionou aumento ou manutenção da potência de relaxamento vascular, que foi mediada pela ativação de receptores presentes no endotélio vascular. Assim, a N-metilação proporciona relaxamento vascular diretamente relacionado à ação na musculatura lisa vascular, de forma semelhante ao LASSBio-785, que é N-metilado, com átomo de enxofre.²⁴ A ação direta na musculatura lisa vascular produzida pelo LASSBio-2063, LASSBio-430 e LASSBio-2092 pode ser vantajosa devido ao fato de que a disfunção endotelial e o remodelamento vascular que ocorrem na hipertensão arterial podem prejudicar a vasodilatação dependente do endotélio.²⁵

As modificações estruturais e os respectivos resultados principais quanto às alterações de potência dos derivados N-acilidrazônicos avaliados neste estudo estão resumidos na Figura 7.

Figura 7
Lista de modificações estruturais e respectivos resultados relacionados à reatividade vascular (Imagem criada por Tadeu L. Montagnoli).

Os mecanismos envolvidos na ação vasodilatadora e no efeito anti-hipertensivo induzidos pelo LASSBio-2062 foram investigados pelos seguintes motivos: (1) sua semelhança com a estrutura química do LASSBio-294 (protótipo) diferia apenas pela substituição do anel tiofênico pelo anel selenofênico; e (2) apresentou potência 4 vezes maior que o protótipo²⁶ em promover relaxamento vascular com ação no endotélio e na musculatura lisa vascular.

A ação vasodilatadora devido à ativação de receptores de adenosina subtipo A_2A, localizados tanto na musculatura lisa vascular quanto no endotélio, já foi demonstrada anteriormente para muitos derivados N-acilidrazônicos.¹⁶,²⁶,²⁷ Assim, foi inicialmente investigado o envolvimento de receptores de adenosina A_2A para relaxamento vascular induzido pelo LASSBio-2062. A eficácia e a potência não foram alteradas na presença de um antagonista do receptor de adenosina A_2A, devido ao fato de que a relação entre a concentração e o relaxamento vascular permaneceu inalterada, sugerindo a não participação da ativação desses receptores no tecido vascular (Figura 3A).

Visto que a ativação dos receptores de adenosina A₃ também desempenha um papel importante no processo de relaxamento vascular,²⁸ a ação do LASSBio-2062 foi avaliada na presença do antagonista MRE 3008F20. A potência e a resposta máxima de relaxamento vascular foram reduzidas na presença do antagonista do receptor de adenosina A₃, indicando a participação da ativação desses receptores na vasodilatação induzida por esses derivados (Figura 3B). Nas artérias coronárias de ratos, a ativação de receptores de adenosina do subtipo A₃²⁹ pelos agonistas N₆-(3-iodobenzil)-adenosina-5’-N-metiluronamida (IB-MECA) e 2-cloro-N₆-(3-iodobenzil)-adenosina-5’-N-metilcarboxamida (Cl-IB-MECA) produz vasodilatação coronária.³⁰

A cardioproteção ocorre com a ativação dos receptores de adenosina A₃, que é abolida pela glibenclamida, um bloqueador do canal de potássio sensível a ATP, indicando que esse receptor pode interferir na ativação desses canais, resultando na sua abertura³¹-³³ e hiperpolarização celular. Não foi observado relaxamento vascular induzido pelo LASSBio-2062 após pré-incubação com glibenclamida em anéis aórticos sem endotélio funcional (Figura 4A). A ativação de canais de potássio sensíveis a ATP expressos na musculatura lisa vascular leva à hiperpolarização da membrana celular do músculo vascular, promovendo vasodilatação.³⁴ A ativação dos receptores de adenosina A₃ influencia a atividade dos canais de K+, especialmente dos canais de potássio sensíveis a ATP, podendo induzir sua abertura,³⁵, ³⁶ o que resulta em hiperpolarização e consequente bloqueio dos canais de Ca²⁺. A redução do influxo de cálcio leva à menor concentração intracelular de cálcio e resulta em vasodilatação³⁴ (Figura 8).

Figura 8
Possíveis mecanismos envolvidos nos efeitos do LASSBio-2062. A ativação do receptor de adenosina A3 pelo LASSBio-2062 pode promover a inibição da AC através da proteína Gi e, consequentemente, levar à redução na produção da AMPc. A subunidade Gβγ pode promover a ativação da PLC, bem como a ativação dos canais de K⁺ e o bloqueio dos canais de Ca²⁺. O receptor de adenosina também está acoplado à proteína Gq, que ativa a PKC e a PLC para promover a vasodilatação. A ativação dos canais K_ATP e o bloqueio dos canais de Ca²⁺ tipo L pelo LASSBio-2062 podem ocorrer diretamente neste canal ou como resultado da ativação do receptor de adenosina A₃. A ativação dos canais de potássio pelo LASSBio-2062 não se restringe ao K_ATP, pois os antagonistas dos canais K_Ca e K_V reduziram a vasodilatação. A₃R: receptor de adenosina subtipo A₃; AC: adenilato ciclase; AMPc: adenosina monofosfato cíclico; ATP: trifosfato de adenosina; βγ: subunidade βγ; BK_Ca: canal de potássio cálcio-dependente de alta condutância; Gi/0: proteína Gi/0; Gq: proteína Gq; K : canal de potássio sensível a ATP; K_V: canal de potássio voltagem-dependente; PKC: proteína quinase C; PLC: fosfolipase C.

Dessa maneira, a ativação do receptor de adenosina A₃ promove a inibição da adenilato ciclase via proteína Gi e, consequentemente, leva à redução da produção de adenosina monofosfato cíclico. O receptor de adenosina A₃ também está acoplado à proteína Gq, que ativa a proteína quinase C, que interage com canais de cálcio no retículo sarcoplasmático e canais de potássio sensíveis a ATP para promover vasodilatação.²⁸,³¹,³⁷,³⁸ Além disso, através da ativação de proteínas Gi/o, via subunidades Gβγ, resulta na ativação de canais de potássio sensíveis a ATP e na redução da entrada de cálcio no ambiente intracelular.³⁹ A ativação de canais de potássio sensíveis a ATP pelo LASSBio-2062 pode ocorrer diretamente neste canal e/ou através da ativação do receptor de adenosina A₃. A ativação dos canais de potássio pelo LASSBio-2062 não se restringe ao canal de potássio sensível a ATP, uma vez que a vasodilatação foi inibida pela exposição aos antagonistas dos canais de potássio voltagem-dependentes e cálcio-dependentes (Figura 4B e 4C, respectivamente).⁴⁰, ⁴¹ A ativação desses canais pode ser um alvo farmacológico alternativo ao tratamento da hipertensão arterial. O maior efluxo de potássio, através de diferentes canais de potássio ativados pelo LASSBio-2062, resultaria em hiperpolarização das células musculares lisas, o que poderia levar ao fechamento dos canais de cálcio e à consequente redução da concentração intracelular de cálcio e vasodilatação. De acordo com os resultados obtidos, o LASSBio-2062 pode promover vasodilatação ativando o receptor de adenosina A₃ e os canais de K+ e bloqueando diretamente os canais de Ca²⁺, conforme indicado na Figura 8.

Alterações estruturais dos receptores de adenosina A₃ ou alterações nos diferentes estágios da via de sinalização interferem no desenvolvimento da hipertensão arterial essencial. Os receptores de adenosina A₃ encontrados em humanos estão envolvidos em várias funções citoprotetoras, enquanto sua ativação está ligada a efeitos anti-inflamatórios e cardioprotetores.⁴² O agonista do receptor de adenosina A₃, namodenoson, tem efeitos anti-inflamatórios, antifibróticos e de anti-esteatose, uma vez que mostrou resultados promissores em um estudo de fase III para o tratamento do câncer de fígado e em um estudo de fase II para o tratamento da esteatohepatite não alcoólica. A namodenoson atua ativando os receptores de adenosina A₃, inibindo a produção de citocinas inflamatórias como fator de necrose tumoral α (TNF-α), interleucina (IL)-12, interferon-ɣ, IL-17 e IL-23 e regulando negativamente o NF-κB.⁴³ Existe uma regulação negativa da expressão do receptor de adenosina A₃ no coração de animais hipertensos,²⁸ indicando que esses receptores são potenciais alvos farmacológicos para o tratamento da hipertensão arterial. O efeito vasodilatador do LASSBio-2062 pode ser mediado pela ativação do receptor de adenosina A₃ e sua administração intravenosa em SHR reduziu a pressão arterial média nas duas doses utilizadas, 10 e 30 μmol/kg (3 e 10 mg/kg). Quando comparamos o efeito anti-hipertensivo do LASSBio-2062 com alguns medicamentos clinicamente disponíveis, identificamos que a inibição dos efeitos da angiotensina II pelo inibidor da enzima conversora de angiotensina enalapril ocorre com a administração intravenosa de 8,2 μg/kg em ratos.⁴⁴ Em contrapartida, a ação anti-hipertensiva desse agonista do receptor de adenosina A₃ foi comparável à descrição da administração intravenosa em ratos hipertensos do anti-hipertensivo losartana (10 mg/kg de antagonista do receptor da angiotensina II).⁴⁵

A ocorrência de bradicardia após administração intravenosa de LASSBio-2062 pode ser benéfica devido à ausência das características de taquicardia reflexa de muitos medicamentos vasodilatadores.⁴⁶

Devido à ativação dos canais de potássio sensíveis a ATP induzida pelo LASSBio-2062, seria esperado o surgimento de efeitos colaterais adversos, como hiperglicemia, por causa da possível redução da liberação de insulina nas células beta pancreáticas.⁴¹, ⁴⁷ Entretanto, há uma diferença entre as subunidades dos canais de potássio sensíveis a ATP nos vários tecidos onde são expressos, que incluem pâncreas, cérebro, coração e músculo liso e esquelético.⁴⁸ O LASSBio-2062 usado como agente anti-hipertensivo provavelmente não afetaria pacientes com diabetes, pois os canais de potássio sensíveis a ATP presentes nos vasos são diferentes daqueles localizados no pâncreas. A ausência de alteração no nível de glicose plasmática após injeção intravenosa de LASSBio-2062 reforça a falta de interferência nos distúrbios metabólicos. A glicemia foi de 139,5 ± 5,0 e 127,0 ± 11,0 mg/dL 10 e 30 minutos após a injeção intravenosa do veículo. O tratamento com LASSBio-2062 (30 umol/kg, intravenoso) não alterou significativamente esse parâmetro com 172,0 ± 24,0 e149,5 ± 24,0 mg/dL.

O novo agonista do receptor de adenosina A₃, LASSBio-2062, representa uma alternativa terapêutica para o tratamento da hipertensão arterial, indicando que o sistema de adenosina é um novo potencial alvo farmacológico. A ativação do receptor de adenosina A₃ tem efeitos benéficos no sistema cardiovascular, pois atenua a condição aterosclerótica,⁴⁹ previne lesão de isquemia/reperfusão miocárdica⁵⁰ e induz vasodilatação coronariana.²⁸ Além disso, a ativação desses receptores expressos em neutrófilos, basófilos, eosinófilos e mastócitos reduz a resposta inflamatória.⁵¹-⁵⁴ Assim, a ativação dos receptores de adenosina A₃ pode, além de produzir vasodilatação, reduzir o componente inflamatório da hipertensão arterial sistêmica, sugerindo múltiplos efeitos benéficos, que são fatores importantes, por se tratar de uma doença multifatorial. O LASSBio-2062 parece atuar em múltiplos alvos, o que poderia facilitar o uso em regime de monoterapia ou combinado com outros medicamentos, proporcionando interação medicamentosa ideal e reduzindo a dose utilizada. A combinação é capaz de reduzir os efeitos adversos e melhorar o controle da doença.⁵⁵

Conclusão

Com exceção do LASSBio-2084, todas as N-acilidrazonas apresentaram ação vasodilatadora mais potente que o protótipo LASSBio-294, provavelmente devido à substituição do anel tiofênico pelo anel selenofênico. O aumento da potência indica melhora na interação alvo molecular-substância. O relaxamento vascular induzido pelo LASSBio-2062 pode ocorrer através da ativação dos receptores de adenosina A₃ e da ativação direta/indireta dos canais de potássio. A administração intravenosa de LASSBio-2062 promoveu efeito anti-hipertensivo, sugerindo que o receptor de adenosina A₃ é um alvo farmacológico inovador para o tratamento da hipertensão arterial.

• Potencial conflito de interesse
  Não há conflito com o presente artigo
• Fontes de financiamento
  O presente estudo foi financiado pela CAPES, CNPq, FAPERJ, INCT-INOFAR.
• Vinculação acadêmica
  Este artigo é parte de dissertação de mestrado de Bruna de Souza Rocha pela Universidade Federal do Rio de Janeiro.
• Aprovação ética e consentimento informado
  Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade Federal do Rio de Janeiro sob o número de protocolo 017/19. Todos os procedimentos envolvidos nesse estudo estão de acordo com a Declaração de Helsinki de 1975, atualizada em 2013.

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Editado por

Editor responsável pela revisão: Marina Okoshi

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  05 Abr 2024
• Data do Fascículo
  2024

Histórico

• Recebido
  20 Jun 2023
• Revisado
  17 Out 2023
• Aceito
  14 Nov 2023