Resistência a antimicrobianos e tolerância ao arsênio em Enterococcus spp. isolados de Leopardus geoffroyi de vida livre em Candiota, no bioma Pampa, Brasil: sentinelas da poluição ambientalResumo
O bioma Pampa abriga uma notável diversidade de espécies endêmicas, mas vem sofrendo intensos impactos decorrentes de atividades antrópicas, que ameaçam a conservação de espécies silvestres, tais como o gato-do-mato-grande (Leopardus geoffroyi). Nesse contexto, este estudo avaliou a resistência a antimicrobianos e a tolerância a metais pesados em enterococos isolados das cavidades oral e retal de 14 gatos-do-mato-grande (L. geoffroyi) de vida livre da região do Seival/Candiota, no bioma Pampa, como bioindicadores da qualidade ambiental. O isolamento foi realizado em meios seletivos, a identificação das espécies foi feita por MALDI-TOF, e a suscetibilidade foi determinada pelo método de disco-difusão frente a 12 antimicrobianos de uso clínico e veterinário. Genes de resistência a antimicrobianos (msrC, ermB, tetM e tetL) e de tolerância a metais pesados (arsA_I, arsA_II e tcrB) foram investigados por PCR. Um total de 111 isolados de enterococos foi recuperado. Enterococcus faecium (37,8 %) e Enterococcus faecalis (29,7 %) predominaram, apresentando distribuição distinta entre amostras orais e retais. No geral, 74,8 % dos isolados apresentaram resistência a pelo menos um antimicrobiano, principalmente à rifampicina (41,4 %), à eritromicina (34,2 %) e à ciprofloxacina (26,1 %). Não foi detectada resistência à gentamicina nem à vancomicina. A resistência a múltiplos antimicrobianos foi observada em 17 isolados (20,5 %). Determinantes de resistência (msrC, ermB, tetM e tetL) e o gene de tolerância ao arsênio (arsA_I) foram identificados, enquanto arsA_II e tcrB não foram detectados. Em conclusão, a presença de enterococos resistentes a múltiplos antimicrobianos e tolerantes ao arsênio em gatos-do-mato-grande de vida livre reforça seu uso como bioindicadores da qualidade ambiental e evidencia o impacto das atividades antrópicas na saúde animal.
Palavras-chave:
Impactos antropogênicos; bioindicadores ambientais; conservação da vida silvestre; saúde única
Abstract
The Pampa Biome harbors a high diversity of endemic species but has experienced substantial pressure from anthropogenic activities that threaten wildlife conservation, including Geoffroy’s cat (Leopardus geoffroyi). Within this context, this study evaluated antimicrobial-resistant and heavy-metal-tolerant enterococci isolated from oral and rectal cavities of 14 free-ranging Geoffroy’s cats (L. geoffroyi) from Seival–Candiota region in Brazilian Pampa as indicators of environmental quality. Isolation was conducted on selective media, species identification was performed using MALDI-TOF mass spectrometry, and antimicrobial susceptibility was assessed by disk diffusion against 12 antimicrobials used in human and veterinary medicine. Antimicrobial resistance genes (msrC, ermB, tetM, and tetL) and heavy-metal tolerance genes (arsA_I, arsA_II, and tcrB) were investigated by PCR. A total of 111 enterococcal isolates were recovered. Enterococcus faecium (37.8 %) and Enterococcus faecalis (29.7 %) predominated, showing distinct distribution between oral and rectal samples. Overall, 74.8 % of isolates were resistant to at least one antimicrobial, mainly rifampicin (41.4 %), erythromycin (34.2 %), and ciprofloxacin (26.1 %). No resistance to gentamicin or vancomycin was detected. Multidrug resistance occurred in 17 isolates (20.5 %). Resistance determinants (msrC, ermB, tetM, and tetL) and arsenic tolerance gene arsA_I were identified, whereas arsA_II and tcrB were not detected. Findings demonstrate the presence of multidrug-resistant and arsenic-tolerant enterococci in free-ranging Geoffroy’s cats, supporting their role as sentinel species of environmental quality and evidencing the influence of anthropogenic activities on animal health.
Keywords:
Anthropogenic impact; environmental bioindicators; wildlife conservation; one health
1. Introdução
O bioma Pampa representa um valioso patrimônio natural e cultural, devido à sua biodiversidade singular e aos serviços ecossistêmicos que sustenta. Com uma área de aproximadamente 700.000 km2, essa formação campestre se estende pelo sul do Brasil, Argentina e Uruguai (1). No Brasil, o Pampa ocorre exclusivamente no estado do Rio Grande do Sul, abrangendo cerca de 193.836 km2, equivalente a 69 % do território gaúcho e a 2.3 % do território nacional (2). O Pampa tem grande importância ambiental, pois abriga uma elevada diversidade de espécies endêmicas de animais, incluindo mais de 500 espécies de aves e mais de 100 de mamíferos terrestres (3). Apesar de sua importância para a conservação da biodiversidade brasileira, o bioma Pampa vem sofrendo perda intensa de vegetação nativa ao longo dos anos. Estimativas apontam que a cobertura original, que correspondia a 41,32 % em 2002, reduziu-se para 36,03 % em 2008 (4). O processo de degradação acelerado, impulsionado principalmente pela expansão agrícola (soja e arroz) e industrial (mineração e celulose), tem resultado em perdas significativas da fauna e da flora originais.
Diante desse cenário, os impactos das atividades antrópicas sobre o ecossistema do Pampa vêm sendo amplamente discutidos e monitorados (5), reforçando a necessidade de iniciativas voltadas à conservação. Nesse contexto, o Projeto Felinos do Pampa tem como foco principal avaliar os efeitos das atividades humanas sobre os felinos silvestres, integrando-se ao Geoffroy’s Cat Working Group - uma rede internacional dedicada à pesquisa e conservação (6). O projeto concentra seus esforços no Pampa brasileiro, tendo o gato-do-mato-grande (Leopardus geoffroyi) como uma das espécies-bandeira de suas ações. Embora classificado como "Pouco Preocupante" em escala global (7), o gato-do-mato-grande encontra-se em situação ameaçado no Brasil, considerado como “Vulnerável” tanto em nível nacional (8) quanto regional (9). Entre as principais ameaças destacam-se a fragmentação de habitats, que expõe a espécie a ambientes cada vez mais antropizados e aumenta os riscos de atropelamentos, a caça retaliatória e a transmissão de doenças provenientes de animais domésticos (10–12).
Além das ameaças diretas à conservação, a detecção de impactos ambientais sutis na microbiota do hospedeiro representa uma dimensão crítica adicional. Nesse sentido, as comunidades microbianas intestinais podem refletir o estado fisiológico do hospedeiro e as pressões ambientais, funcionando assim como indicadores de distúrbios nos ecossistemas e da influência antrópica (13,14). Entre os microrganismos utilizados como bioindicadores, o gênero Enterococcus tem recebido atenção especial (15–21). Espécies de Enterococcus são consideradas comensais do trato gastrointestinal, podendo ser encontrados no trato geniturinário, além da cavidade oral de humanos e animais, podendo também ser encontradas em ambientes externos, como solo, água e alimentos (22–28). De acordo com evidências moleculares e filogenéticas, o gênero inclui mais de 90 espécies, entre as quais E. faecalis, E. faecium, E. hirae, E. durans, E. casseliflavus, E. gallinarum e E. mundtii são as mais frequentemente encontradas no trato gastrointestinal de animais (29). Nos últimos anos, tem-se dado atenção crescente à caracterização da diversidade de enterococos, dos perfis de resistência a antimicrobianos e da tolerância a metais pesados em isolados obtidos de animais silvestres. Esses estudos têm destacado o potencial dos enterococos como organismos sentinela para o monitoramento da saúde animal e dos ecossistemas em ambientes potencialmente contaminados (23–28, 30–33).
Apesar da importância ecológica do Pampa e da vulnerabilidade de espécies como o L. geoffroyi, ainda são escassos estudos que caracterizem sua microbiota intestinal e oral sob a perspectiva de bioindicadores ambientais. Investigar essa interface é essencial para compreender os efeitos das pressões antrópicas e contribuir para estratégias de conservação alinhadas à Saúde Única. Assim, este estudo teve como objetivo caracterizar a suscetibilidade a antimicrobianos e tolerância a metais pesados de espécies de Enterococcus isoladas das cavidades oral e retal de gatos-do-mato-grande (L. geoffroyi) de vida livre capturados na região de Seival em Candiota, do bioma Pampa. Por fim, busca também explorar sua aplicabilidade como bioindicadores da qualidade ambiental em habitats naturais ocupados por esta espécie.
2. Material e métodos
2.1 Área de estudo – Pampa brasileiro: município de Candiota
O município de Candiota está localizado na região sul do estado do Rio Grande do Sul, a aproximadamente 387 km da capital, Porto Alegre. Com uma área total de 933,628 km2 e população estimada de 10.710 habitantes, apresenta uma densidade demográfica de 11,47 hab/km2 (34). Deste total, cerca de 73.234,754 hectares são destinados a atividades agropecuárias, correspondendo a 78,4 % do território municipal. A economia local é fortemente influenciada pela geração de energia termelétrica, em razão da abundância de carvão mineral em seu subsolo. Atualmente, Candiota abriga três grandes empresas mineradoras e termelétricas, além de fábricas de cimento vinculadas a um dos maiores conglomerados do setor a nível global, posicionando o município como um polo estratégico no cenário energético nacional. De forma complementar, destacam-se a pecuária e a agricultura, sobretudo pela produção de soja e arroz (35).
2.2 Amostragem e coleta de material biológico de L. geoffroyi
Quatorze gatos-do-mato-grande (L. geoffroyi) de vida livre foram capturados entre junho de 2022 e fevereiro de 2023, na região do Seival, distrito do município de Candiota, Rio Grande do Sul, Brasil (Tabela Suplementar 1). As capturas integraram o Projeto Felinos do Pampa e seguiram os protocolos metodológicos descritos por Tirelli et al (12), além das diretrizes para manejo de mamíferos silvestres propostas por Sikes et al (36). As capturas foram autorizadas pelo Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade (ICMBio), por meio da licença ICMBIO/SISBIO-81869-2, com finalidade estritamente científica. Todos os procedimentos envolvendo animais foram previamente avaliados e aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), conforme o protocolo CEUA/UFRGS-42867.
Suabes das cavidades oral e retal foram coletadas de cada animal, acondicionados em meio de transporte Stuart e transportados sob refrigeração (4 °C) até o Laboratório de Microbiologia de Animais Silvestres do Instituto de Ciências Básicas da Saúde (ICBS) da UFRGS, onde foram mantidos refrigerados até a realização das análises microbiológicas.
2.3 Isolamento e caracterização fenotípica de bactérias do gênero Enterococcus
Para a seleção de bactérias do gênero Enterococcus, os suabes da cavidade oral (CO) e retal (CR) foram imersos em tubos contendo 3 mL de caldo Azida Dextrose (Azide Dextrose Broth, Himedia®, Índia) e incubados a 37 °C por 24 h. Em seguida, foi realizada uma diluição seriada decimal em solução salina estéril a 0,85 % de NaCl. Cem microlitros das diluições 10−4 e 10−5 foram semeados em placas de ágar Infusão Cérebro-Coração (Brain Heart Infusion, BHI) suplementado com 4,5 % de NaCl, pelo método de espalhamento em superfície, seguidos de incubação a 37 °C por 24 h. Após a incubação, seis unidades formadoras de colônia (UFC) foram selecionadas aleatoriamente, repicadas em ágar Bile Esculina e incubadas sob as mesmas condições. As colônias que apresentaram escurecimento foram então repicadas em ágar BHI e incubadas a 37 °C por 24 h para análises subsequentes. As culturas selecionadas foram submetidas a testes fenotípicos morfofisiológicos, incluindo coloração de Gram e teste da atividade da enzima catalase, para identificação presuntiva do gênero Enterococcus. Os isolados com características fenotípicas compatíveis com o gênero foram armazenados em criotubos contendo 1 mL de meio de conservação composto por 10 % de leite desnatado e 10 % de glicerol a −20 °C, para posterior identificação molecular em nível de espécie (24, 27).
2.4 Identificação das espécies de Enterococcus
Para identificação de espécies, a técnica de ionização e dessorção a laser assistida por matriz (MALDI – TOF/Bruker Daltonik GmbH) foi utilizada segundo Sauget et al (37) Para diferenciação de E. gallinarum e E. casseliflavus, espécies que exibem resistência intrínseca de baixo nível à vancomicina, foram realizados dois testes bioquímicos conforme relatado por Cartwright et al (38) Para o teste de produção de pigmento, uma colônia de cada cultura foi cuidadosamente retirada com um cotonete estéril e observada quanto à coloração amarela, indicativo da espécie E. casseliflavus. Além disso, foi realizado o teste da motilidade, por meio da introdução de agulha com colônia bacteriana, em coluna reta até a profundidade de 2/3 em meio de cultura semissólida de ágar BHI e, posteriormente, incubação por 24 h a 37ºC. Nesse teste, E. casseliflavus apresenta resultado positivo e E. munditti negativo, o que permite classificar corretamente cada espécie.
2.5 Determinação do perfil de suscetibilidade aos antimicrobianos
Os isolados de Enterococcus também foram submetidos à determinação do perfil de suscetibilidade aos antimicrobianos por meio do teste de disco-difusão em ágar Mueller-Hinton, conforme o método padronizado de Kirby-Bauer et al (39) Para cada amostra bacteriana, um inóculo foi preparado em 5 mL de solução salina a 0,85 % de NaCl, com posterior ajuste da turbidez para o padrão 0,5 da escala de McFarland (aproximadamente 1,5 × 108 UFC/mL). As suspensões foram semeadas em placas contendo ágar Mueller-Hinton (Mueller-Hinton Agar, Acumedia®, Neogen, Michigan), utilizando o método de espalhamento em superfície com auxílio de swab estéril. Em seguida, os discos impregnados com os antimicrobianos foram aplicados sobre o meio, e as placas foram incubadas a 37 °C por 24 h.
Após o período de incubação, os diâmetros dos halos de inibição foram medidos em milímetros e interpretados de acordo com os critérios estabelecidos pelo Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (40), sendo os isolados classificados como sensíveis (S), sensibilidade intermediária (I) ou resistentes (R). Os seguintes antimicrobianos foram testados: ampicilina (10 µg), vancomicina (30 µg), rifampicina (5 µg), tetraciclina (30 µg), ciprofloxacina (5 µg), norfloxacina (10 µg), cloranfenicol (30 µg), nitrofurantoína (300 µg), linezolida (10 µg), eritromicina (15 µg), gentamicina (120 µg) e estreptomicina (300 µg), conforme recomendações do CLSI/2021.
Cepas intermediárias e resistentes foram agrupadas em uma única categoria como cepas resistentes. As cepas foram classificadas como apresentando fenótipo de resistência simples (SR), dupla (DR) ou multirresistente (MDR) se apresentassem resistência a uma, duas ou três ou mais classes de antimicrobianos, respectivamente (41).
2.6 Extração do DNA genômico e detecção dos genes relacionados à resistência aos antimicrobianos e aos metais pesados
A extração do DNA genômico dos isolados de Enterococcus foi realizada por lise química, segundo o protocolo descrito por Bell et al (42). O DNA obtido foi armazenado a −20 °C até sua utilização nas reações de amplificação por reação em cadeia da polimerase (PCR- Polymerase Chain Reaction), destinadas à detecção dos genes relacionados à resistência a antimicrobianos e metais pesados. As reações de PCR foram conduzidas com base nos parâmetros previamente padronizados, conforme detalhado na Tabela 1.
Os oligonucleotídeos iniciadores e os parâmetros de PCR empregados na detecção de genes associados ao arsênio, cobre, eritromicina e tetraciclina em Enterococcus spp.
A detecção dos genes de resistência aos antibióticos foi realizada em todas as amostras que apresentaram fenótipo resistente à eritromicina e à tetraciclina. Esses antimicrobianos são amplamente utilizados na medicina humana e veterinária, e os mecanismos de resistência associados a esses genes em enterococos são frequentemente relacionados com elementos genéticos móveis. Nessas cepas, foi realizada a PCR para a detecção dos genes de resistência à eritromicina ermB e msrC e assim como dos genes de resistência à tetraciclina tetL e tetM. As cepas de Enterococcus spp. 485 e E. faecium CM5-2 foram utilizadas como controles positivos para ermB e msrC, respectivamente. Para o controle positivo dos genes tetL e tetM da tetraciclina foram usadas as cepas de E. faecium CM11-3 e CM5-6.
Para investigar os genes associados aos metais pesados, todas as cepas isoladas foram testadas para os genes arsA_I e arsA_II, que conferem resistência ao arsênio, e para o gene tcrB, que confere resistência ao cobre. Como controle positivo foi utilizada a cepa E. faecalis ATCC 29212 para arsA_I e tcrB, enquanto a cepa L. monocytogenes ALD11249.1 para a detecção do gene arsA_II (21).
3. Resultados e discussão
Visando avaliar o potencial efeito das atividades antrópicas sobre populações de gatos-do-mato-grande (L. geoffroyi) de vida livre capturados na região do Seival, em Candiota, no bioma Pampa, enterococos isolados das cavidades oral e retal de L. geoffroyi foram utilizados como bioindicadores.
3.1 Distribuição das espécies de Enterococcus na cavidade oral e retal de L. geoffroyi
No presente estudo, um total de 111 cepas de Enterococcus spp. foram isoladas de amostras das cavidades orais (CO) e retais (CR) de 14 gatos-do-mato-grande (L. geoffroyi) de vida livre da região do Seival, entre junho de 2022 e fevereiro de 2023. De cada amostra, foram selecionadas, em média, três a quatro colônias com morfologia compatível com o gênero. Do total de isolados, 50 (45 %) foram obtidos de suabes orais e 61 (55 %) de suabes retais (Tabela Suplementar 2).
Entre as espécies identificadas, E. faecium (37,8 %; n = 42) e E. faecalis (29,7 %; n = 33) foram as mais frequentes, seguidas por E. hirae (13,5 %; n = 15), E. casseliflavus (9,9 %; n = 11), E. durans (7,2 %; n = 8) e E. mundtii (1,8 %; n = 2). A distribuição das espécies variou de acordo com o sítio anatômico de amostragem. As amostras orais foram compostas principalmente por E. faecalis e E. faecium, enquanto as amostras retais apresentaram maior diversidade de espécies, incluindo maior frequência de E. hirae e detecção exclusiva de E. mundtii (Figura 1).
Distribuição das espécies de Enterococcus spp. (a) e perfil de resistência aos antimicrobianos (b) entre as amostras da cavidade oral e retal de gatos-do-mato-grande (L. geoffroyi) de vida livre capturados na região do Seival, em Candiota,no bioma Pampa, Brasil entre junho de 2022 e fevereiro de 2023.
As diferentes espécies de enterococos identificadas no estudo parecem refletir a dieta desse felino, a qual é composta, principalmente, por mamíferos e aves de pequeno porte (48–52). A elevada frequência de E. faecalis pode estar associada à ingestão de roedores, já que Lauková et al (53) relataram 70 % dessa espécie em intestinos de roedores selvagens. De forma semelhante, a ocorrência de E. faecalis, E. faecium, E. mundtii, E. durans e E. hirae pode refletir o consumo de aves, já que essas espécies são comumente encontradas em aves silvestres (54) e frangos de corte (55). Assim, o perfil de enterococos observado nesse estudo sugere que a alimentação dos gatos-do-mato influencia significativamente a colonização de sua microbiota oral e intestinal.
3.2 Perfil de resistência das cepas de enterococos isoladas de L. geoffroyi
Dentre as 111 cepas analisadas quanto ao perfil de suscetibilidade aos antimicrobianos testados, 83 (74,8 %) apresentaram resistência a pelo menos um dos antimicrobianos testados, conforme detalhado na Tabela 2. As maiores frequências de resistência foram observadas para rifampicina (41,4 %), eritromicina (34,2 %) e ciprofloxacina (26,1 %). Em menor proporção, houve resistência à tetraciclina (13,5 %), à norfloxacina (9,9 %), à nitrofurantoína (4,5 %), à estreptomicina (2,7 %), à linezolida (1,8 %), à ampicilina (0,9 %) e ao cloranfenicol (0,92 %). Nenhuma cepa apresentou suscetibilidade à gentamicina ou à vancomicina.
Número (%) de espécies de enterococos resistentes aos antimicrobianos isolados da cavidade oral e retal de gatos-do-mato-grande (Leopardus geoffroyi) de vida livre capturados na região do Seival, em Candiota, no bioma Pampa entre junho de 2022 e fevereiro de 2023.
Os enterococos isolados da cavidade retal apresentaram frequência e complexidade de resistência mais elevadas em comparação com os isolados da cavidade oral. Nos isolados das amostras orais a rifampicina foi o antimicrobiano com maior frequência de resistência (42 %), seguida por eritromicina (28 %) e ciprofloxacina (22 %). Nos isolados retais o percentual de resistência foi maior para rifampicina (41 %), eritromicina (39 %) e ciprofloxacina (33 %). A tetraciclina apresentou resistência moderada em ambos os sítios, sendo mais frequente na cavidade retal (20 % versus 12 %). Resistência à norfloxacina, linezolida e nitrofurantoína foi relativamente baixa em ambos os grupos, embora ligeiramente mais elevada nos isolados retais (Figura 1b). Espécies como E. faecium, E. faecalis, E. durans e E. casseliflavus contribuíram de forma diferenciada para esses perfis, evidenciando que a cavidade retal concentra enterococos com maior frequência de resistência e maior diversidade de padrões multirresistentes em comparação à cavidade oral (Tabelas Suplementares 3 e 4).
O resultado demonstra que os enterococos isolados da cavidade oral e retal de gatos-do-mato-grande de vida livre apresentaram resistência a antimicrobianos amplamente utilizados tanto na clínica humana quanto na medicina veterinária, com destaque para ciprofloxacina, eritromicina, rifampicina e tetraciclina (56–58). A presença de cepas resistentes em animais silvestres, que não recebem tratamentos antimicrobianos, sugere aquisição por dieta ou exposição a ambientes contaminados.
Dessa forma, a detecção de enterococos resistentes em amostras de gatos-do-mato-grande em vida livre provavelmente decorre do contato com atividades antrópicas em seus habitats. Os animais estudados são encontrados em áreas submetidas a esses tipos de atividades, incluindo a pecuária, que gera resíduos de antibióticos que podem atingir o solo, a água e os corpos hídricos, favorecendo a seleção e a disseminação de bactérias resistentes. Essas observações destacam a influência de ambientes antropizados na microbiota de animais silvestres e reforçam o valor dos enterococos como indicadores sentinela da qualidade ambiental em abordagens integradas de vigilância de Saúde Única (58-60).
Dentre as 83 cepas resistentes, 45 (54,2 %) apresentaram resistência simples (SR), 21 (25,3 %) dupla (DR) e 17 (20,5 %) multirresistentes (MDR). Os enterococos isolados da cavidade retal apresentaram maior proporção de cepas MDR em comparação com os isolados da cavidade oral (Figura 2). A presença de cepas MDR pode estar associada à proximidade desses animais com atividades humanas, já que canídeos e felídeos selvagens compartilham o mesmo ambiente. Estudos anteriores reportaram enterococos MDR isolados de suabes retais de gatos-do-mato do bioma Pampa e de processos infecciosos em gatos domésticos hospitalizados no Sul do Brasil (27, 56). Esses achados reforçam a preocupação com a seleção e disseminação de bactérias multirresistentes entre animais e humanos.
Perfil de resistência aos antimicrobianos de enterococos isolados de amostras de cavidade oral (CO) e retal (CR) de gatos-do-mato-grande de vida livre capturados na região do Seival, em Candiota, no bioma Pampa, entre junho de 2022 e fevereiro de 2023. S: sensível, SR: resistência simples, DR: resistência dupla, MDR: resistência múltipla.
A influência das atividades humanas na ocorrência de Enterococcus sp. resistentes em animais silvestres tem se tornado cada vez mais evidente, refletindo a relação entre pressão antrópica e a disseminação de mecanismos de resistência. Heck et al (28) avaliaram enterococos isolados de serpentes de vida livre e em cativeiro e observaram que os animais sem contato com humanos apresentaram perfis de sensibilidade a todos os antimicrobianos testados. Em contraste, as cepas isoladas de serpentes mantidas em cativeiro apresentaram resistência a várias classes de antibióticos. Da mesma forma, em estudo realizado com amostras de macacos-prego (Sapajus nigritus) de vida livre, com contato frequente com humanos, verificou-se uma maior frequência de cepas resistentes, sugerindo que a exposição a ambientes antropizados pode favorecer a seleção e disseminação desses microrganismos (23).
3.3 Detecção dos genes associados à resistência à tetraciclina (tetL e tetM) e eritromicina (msrC e ermB), e tolerância ao arsênio (arsA_I e arsA_II) e cobre (tcrB)
Após a análise do perfil de suscetibilidade das 111 cepas de enterococos, observou-se que isolados oriundos de um mesmo animal apresentaram padrões semelhantes de suscetibilidade ou resistência aos antimicrobianos testados, sugerindo possível relação clonal entre esses isolados. Para evitar superestimação na análise da presença de genes de resistência a antimicrobianos e tolerância a metais pesados, foram selecionadas 81 cepas com características fenotípicas distintas, 41 da cavidade retal (CR) e 40 da cavidade oral (CO).
Para a detecção dos determinantes de resistência, 30 cepas resistentes à eritromicina e 18 à tetraciclina foram submetidas à PCR convencional para detecção dos genes ermB e msrC (eritromicina) e tetL e tetM (tetraciclina) (Tabela 3). Entre as cepas resistentes à eritromicina, 13 apresentaram genes de resistência, das quais 12 (40,0 %) foram positivas para msrC e uma (3,3 %) apresentou concomitantemente os genes ermB e msrC. Das cepas positivas para msrC, 12 (92,3 %) pertenciam eram E. faecium e uma (7,7 %) E. durans. A cepa com ambos os genes foi identificada como E. faecium e isolada da cavidade oral. A presença do gene msrC em enterococos tem sido observada em amostras coletadas de animais silvestres (23, 2) e a literatura descreve o gene como específico para E. faecium (61), o que confirma a hipótese levantada, em que doze amostras positivas para o gene eram da espécie. Por outro lado, 17 cepas (56,6 %) não apresentaram amplificação de nenhum dos genes analisados, sugerindo a presença de outros genes de resistência à eritromicina não investigados neste estudo.
Detecção de genes que conferem resistência à tetraciclina e à eritromicina e ao arsênio nas cepas de enterococos coletados da cavidade oral e retal de gatos-do-mato-grande (Leopardus geoffroyi) de vida livre capturados na região do Seival, em Candiota, no bioma Pampa entre junho de 2022 e fevereiro de 2023.
Das 18 cepas resistentes à tetraciclina, 5 (27,7 %) foram positivas para o gene tetM, uma (5,5 %) para tetL e 8 (44,4 %) para ambos os genes (Tabela 3). O gene tetM foi identificado em E. faecium (n=9), seguido por E. durans (n=2), E. faecalis (n=1) e E. casseliflavus (n=1). O gene tetL foi identificado em E. faecium (n=5), E. durans (n=3) e E. casseliflavus (n=1). Quatro cepas foram negativas para os genes testados, podendo ser positivas para outros genes associados à resistência à tetraciclina em enterococos.
Os resultados observados para os genes tetL e tetM estão de acordo com estudos anteriores que avaliaram a presença desses genes em enterococos de animais silvestres, como no estudo de Araújo (27). A elevada frequência do gene tet pode ser explicada por sua frequente associação com plasmídeos e elementos genéticos móveis ou conjugativos, que facilitam a transferência horizontal entre populações bacterianas (61, 62).
Todas as cepas também foram submetidas à PCR para detecção dos genes arsA_I e arsA_II, associados à tolerância ao arsênio (Tabela 3). Trinta e seis (44,4 %) cepas foram positivas para arsA_I, enquanto nenhuma apresentou amplificação para arsA_II. Em relação ao gene tcrB, associado à resistência ao cobre, todas as cepas testadas foram negativas.
A presença do gene arsA_I em enterococos isolados de felídeos de vida livre sugere que microrganismos tolerantes ao arsênico podem ser selecionados sob pressões de contaminação ambiental nesse habitat. A mineração e agricultura, exercidas amplamente na região de estudo, podem ser as fontes potenciais de poluição por arsênio (63). Recentemente, Mocellin et al (33) observaram uma associação da presença dos genes arsA em enterococos isolados de aves marinhas do Arquipélago de Abrolhos que apresentavam níveis elevados de As, Fe, Mn, Cd e Pb no sangue e/ou na plumagem após rompimento da barragem de Fundão. Esses achados reforçam a hipótese de que a ocorrência de genes de tolerância ao arsênico em enterococos ambientais reflete pressões seletivas exercidas pela exposição a metais por meio de cadeias alimentares e/ou habitats contaminados.
4. Conclusão
Enterococos resistentes a diversos antimicrobianos foram isolados das cavidades oral e retal de gatos-do-mato-grande (L. geoffroyi) de vida livre capturados na região do Seival, em Candiota, no bioma Pampa, RS. Esses isolados carregaram genes de resistência à tetraciclina e à eritromicina (msrC, tetL, tetM), bem como o gene de tolerância ao arsênio (arsA_I). A detecção dessas cepas evidencia a exposição dos felinos a ambientes impactados por atividades antrópicas. Portanto, esse estudo reforça o potencial dos enterococos como bioindicadores ambientais, ressaltando sua importância para a compreensão da interface entre saúde animal, saúde humana e conservação dos ecossistemas.
Material suplementar
(disponível apenas na versão online:https://revistas.ufg.br/vet/article/view/84024)
Supplementary PDF
Tabela S1. Informações biológicas e de captura dos gatos-do-mato-grande (L. geoffroyi) de vida livre empregados presente no estudo.
Tabela S2. Distribuição das espécies de Enterococcus spp. entre as amostras da cavidade oral e retal de gatos-do-mato-grande de vida livre capturados na região do Seival, em Candiota, no bioma Pampa entre junho de 2022 e fevereiro de 2023.
Tabela S3. Número (%) de cepas de enterococos resistentes isoladas da cavidade oral de gatos-do-mato-grande de vida livre capturados na região do Seival, em Candiota, no bioma Pampa entre junho de 2022 e fevereiro de 2023.
Tabela S4. Número (%) de cepas de enterococos resistentes isoladas da cavidade retal de gatos-do-mato-grande de vida livre capturados na região do Seival, em Candiota, no bioma Pampa entre junho de 2022 e fevereiro de 2023.
Declaração de disponibilidade de dados
O conjunto completo de dados que suporta os resultados deste estudo foi publicado no artigo e na seção "Material Suplementar".
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Declaração de uso de IA generativa
Durante a preparação deste manuscrito, os autores utilizaram o ChatGPT para gerar a imagem do gato-do-mato apresentada na Figura 1. Após a utilização desta ferramenta/serviço, os autores revisaram e editaram o conteúdo apropriadamente e assumem total responsabilidade pelo conteúdo da publicação.
Agradecimentos
Agradecemos ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) do Governo Brasileiro, à Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), Porto Alegre, Brasil e ao Projeto Felinos do Pampa.
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Luiz Augusto B. Brito
