Investigación de variantes génicas de canales iónicos en pacientes con síndrome del QT largo

Resúmenes

FUNDAMENTO: A síndrome do QT longo (SQTL) é uma síndrome arrítmica herdada com aumento do intervalo QT e risco de morte súbita. Mutações nos genes KCNQ1, KCNH2 e SCN5A respondem por 90% dos casos com genótipo determinado, e a genotipagem é informativa para aconselhamento genético e melhor manejo da doença. OBJETIVO: Investigação molecular e análise computacional de variantes gênicas de KCNQ1, KCNH2 e SCN5A associadas à SQTL em famílias portadoras da doença. MÉTODOS: As regiões codificantes dos genes KCNQ1, KCNH2 e SCN5A de pacientes com SQTL e familiares foram sequenciadas e analisadas utilizando o software Geneious ProTM. RESULTADOS: Foram investigadas duas famílias com critérios clínicos para SQTL. A probanda da Família A apresentava QTC = 562 ms, Escore de Schwartz = 5,5. A genotipagem identificou a mutação G1714A no gene KCNH2. Foi observado QTC = 521 ± 42 ms nos familiares portadores da mutação contra QTC = 391 ± 21 ms de não portadores. A probanda da Família B apresentava QTc = 551 ms, Escore de Schwartz = 5. A genotipagem identificou a mutação G1600T, no mesmo gene. A análise dos familiares revelou QTC = 497 ± 42 ms nos portadores da mutação, contra QTC = 404 ± 29 ms nos não portadores. CONCLUSÃO: Foram encontradas duas variantes gênicas previamente associadas à SQTL em duas famílias com diagnóstico clínico de SQTL. Em todos os familiares portadores das mutações foi observado o prolongamento do intervalo QT. Foi desenvolvida uma estratégia para identificação de variantes dos genes KCNQ1, KCNH2 e SCN5A, possibilitando o treinamento de pessoal técnico para futura aplicação na rotina diagnóstica.

Síndrome do QT longo; canais iônicos; mutação; morte súbita cardíaca

BACKGROUND: The long QT syndrome (LQTS) is an inherited arrhythmia syndrome with increased QT interval and risk of sudden death. Mutations in genes KCNQ1, KCNH2 and SCN5A account for 90% of cases with genotype determined, and genotyping is informative for genetic counseling and better disease management. OBJECTIVE: Molecular investigation and computational analysis of gene variants of KCNQ1, KCNH2 and SCN5A associated with LQTS, in families with the disease. METHODS: The coding regions of genes KCNQ1, KCNH2 and SCN5A in patients with LQTS and their family members were sequenced and analyzed using Geneious ProTM software. RESULTS: Two families with clinical criteria for LQTS were investigated. The proband of Family A had QTC = 562 ms, Schwartz Score = 5.5. The genotyping identified the G1714A mutation in the KCNH2 gene. QTC = 521 ± 42 ms was observed in family members carrying the mutation against QTC = 391 ± 21 ms for non-carriers. The proband of Family B had QTc = 551 ms, Schwartz Score = 5.5. The genotyping identified the G1600T mutation, in the same gene. The analysis of family members revealed QTC = 497 ± 42 ms in mutation carriers, compared with QTC = 404 ± 29 ms in non-carriers. CONCLUSION: Two gene variants previously associated with LQTS were found in two families clinically diagnosed with LQTS. The prolongation of the QT interval was observed in all family members carrying the mutations. A strategy was developed to identify variants of genes KCNQ1, KCNH2 and SCN5A, making it possible to train technical staff for future application to diagnosis routine.

Long QT syndrome; ion channels; mutation; death sudden cardiac

ARTÍCULO ORIGINAL

^IFaculdade de Medicina, Universidade Federal do Rio de Janeiro

^IIIInstituto Nacional de Cardiologia

^IIIInstituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, UFRJ, Rio de Janeiro, RJ - Brasil

Correspondencia

RESUMEN

FUNDAMENTO: El síndrome del QT largo (SQTL) es un síndrome arrítmico heredado con aumento del intervalo QT y riesgo de muerte súbita. Mutaciones en los genes KCNQ1, KCNH2 y SCN5A responden por 90% de los casos con genotipo determinado, y el genotipaje es informativo para aconsejamiento genético y mejor manejo de la enfermedad.

OBJETIVO: Investigación molecular y análisis computacional de variantes génicas de KCNQ1, KCNH2 y SCN5A asociadas a la SQTL en familias portadoras de la enfermedad.

MÉTODOS: Las regiones codificantes de los genes KCNQ1, KCNH2 y SCN5A de pacientes con SQTL y familiares fueron secuenciadas y analizadas utilizando el software Geneious Pro^®.

RESULTADOS: Fueron investigadas dos familias con criterios clínicos para SQTL. La probanda de la Familia A presentaba QT_C = 562 ms, Escore de Schwartz = 5,5. El genotipaje identificó la mutación G1714A en el gen KCNH2. Fue observado QT_C = 521 ± 42 ms en los familiares portadores de la mutación contra QT_C = 391 ± 21 ms de no portadores. La probanda de la Familia B presentaba QT_C = 551 ms, Escore de Schwartz = 5. El genotipaje identificó la mutación G1600T, en el mismo gen. El análisis de los familiares reveló QT_C = 497 ± 42 ms en los portadores de la mutación, contra QT_C = 404 ± 29 ms en los no portadores.

CONCLUSIÓN: Fueron encontradas dos variantes génicas previamente asociadas a la SQTL en dos familias con diagnóstico clínico de SQTL. En todos los familiares portadores de las mutaciones fue observada la prolongación del intervalo QT. Fue desarrollada una estrategia para identificación de variantes de los genes KCNQ1, KCNH2 y SCN5A, posibilitando el entrenamiento de personal técnico para futura aplicación en la rutina diagnóstica.

Palabras clave: Síndrome del QT largo, canales iónicos, mutación, muerte súbita cardíaca.

Introducción

El síndrome del QT largo (SQTL)^1,2 es una enfermedad genética con prevalencia de 1:2.000³ que cursa con riesgo de muerte súbita por arritmias ventriculares en un corazón estructuralmente normal⁴. El diagnóstico es hecho a través del escore de Schwartz⁵, que combina criterios electrocardiográficos y de la historia clínica, clasificando la probabilidad de SQTL en "baja" (< 1) "intermedia" (2 y 3) y "alta" (> 4). Un escore de Schwartz > 4 tiene especificidad > 99% para el diagnóstico de la SQTL⁶.

Diferentes tipos de SQTL son provocados por variantes en genes de canales iónicos^7,8 y en el gen de la ankirina⁹. Actualmente son descriptos 12 tipos¹⁰, sin embargo los tipos 1, 2 y 3 responden por 90% de los casos con genotipo identificado¹¹. Aunque más de 700 variantes hayan sido descriptas¹², en 29% de los casos la base genética no fue identificada¹³. Los varios tipos de SQTL difieren en cuanto al riesgo de muerte súbita¹⁴, a los gatillos para los episodios de arritmia^15,16 y la respuesta al tratamiento farmacológico^17,18. Además de eso, la gravedad depende de la región afectada del canal¹⁹, lo que vuelve la identificación de la mutación importante para el manejo de la enfermedad.

A pesar del gran número de variantes envueltas, la investigación de variantes génicas asociadas a la SQTL (genotipaje) está siendo cada vez más utilizada en la práctica clínica. Que sea de nuestro conocimiento, ninguna unidad del Sistema Único de Salud realiza actualmente el genotipaje de la SQTL. Por esta razón, fueron investigadas variantes génicas asociadas a la SQTL en dos familias con diagnóstico clínico de la enfermedad. Las condiciones de genotipaje de los genes KCNQ1, KCNH2 y SCN5A fueron establecidas, y fue utilizado análisis computacional para la identificación facilitada de mutaciones ya descriptas y de nuevas variantes génicas en la población brasileña.

Métodos

Pacientes

Pacientes encaminados al Instituto Nacional de Cardiología con sospecha clínica de SQTL fueron sometidos a anamnesis y examen físico por un cardiólogo con experiencia en SQTL (FESCFº). Los electrocardiogramas fueron analizados independientemente por dos investigadores (EC y FESCFº), y la medida del intervalo QT realizada por el método de la tangente²⁰. Ninguno de los probandos presentaba señales electrocardiográficos de hipertrofia cardíaca, disturbios de la conducción o isquemia miocárdica. Probandos con escore de Schwartz > 4 y familiares en primer grado fueron sometidos a análisis molecular, en un total de 29 individuos de dos familias.

Extracción de DNA y reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

El DNA genómico era extraído de sangre periférica²¹. Los exones correspondientes a las regiones codificantes de los 3 genes investigados eran amplificados por PCR utilizando los iniciadores previamente descriptos^22,23. Los exones de los genes KCNQ1 y KCNH2 eran amplificados utilizando, respectivamente, los programas "B" y "C" previamente publicados por Syrris et al²⁴. Para amplificación de los exones 1A de KCNQ1 y 4 de KCNH2 era agregado a la reacción el reactivo PCRx Enhancer (Invitrogen), según las instrucciones del fabricante. Los exones del gen SCN5A eran amplificados utilizando condiciones establecidas por nosotros: 0,2 mM dXTP, 3 mM MgCl₂, 0,5 µM de iniciadores (senso+antisenso), 0,625 UI de Taq DNA polimerasa recombinante (Invitrogen), 200 ng de DNA molde, en un volumen final de 50 µl. El programa consistía en 94º C/10 min; 30 ciclos de 94º C/1 min, 58º C/1 min. , 72º C/2 min. ; extensión final a 72º C/10 min.

Secuenciamiento automático de DNA

El secuenciamiento de productos de PCR purificados en filtros Millipore PCR Cleanup era realizado utilizando iniciadores senso o antisenso, en un equipamiento MegaBACE 1000 (Amersham Biosciences) con reactivos DYEnamic ET Dye Terminator Kit (GE Healthcare Life Systems) según las instrucciones del fabricante.

Análisis de las secuencias obtenidas para identificación de las mutaciones.

Fue utilizado el software Geneious Pro^®25 para análisis de las secuencias obtenidas y generación de mapas de mutaciones ya descriptas para los genes estudiados. Resumidamente, las secuencias de las regiones codificante y genómicas de los genes KCNQ1 (nº de acceso NM_000218 y NG_008935.1), KCNH2 (nº de acceso NM_000238 y NG_008916) y SCN5A (nº de acceso NM_000335 y NG_008934.1) fueron importadas del GenBank y las mutaciones conocidas (Inherited Arrhythmias Database¹²) agregadas a éstas en el software con las respectivas referencias bibliográficas. En seguida fueron señalados los lugares de anillamiento de los iniciadores, intrónicos en su mayoría, utilizados en las reacciones de amplificación y las porciones centrales de los intrones fueron removidas para facilitar el análisis. La comparación directa de los mapas de mutaciones con las secuencias obtenidas de pacientes permite visualizar simultáneamente la calidad del secuenciamiento y las mutaciones previamente descriptas.

Consideraciones éticas

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética en Investigación del Instituto Nacional de Cardiología (proceso nº 0187/4.01.08). Los pacientes y familiares fueron informados de los objetivos y riesgos del estudio y concordaron en participar del mismo a través de firma del término de consentimiento libre y aclarado.

Resultados

Fue realizada investigación de variantes génicas de KCNQ1, KCNH2 y SCN5A en dos familias con diagnóstico clínico de SQTL, incluyendo en el análisis dos probandos y sus respectivos familiares, completando 11 individuos en la Familia A y 17 en la Familia B. El análisis de las variantes fue optimizada mediante creación de mapas de mutación con el software Geneious Pro^® (datos no mostrados).

La probanda de la Familia A (Figura 1A, paciente A2.21), de 36 años, comenzó a sentir palpitaciones a los 15 años; a los 24 años empezó a presentar episodios de palpitaciones seguidas de síncope desencadenados por estrés emocional, ruidos súbitos y en el despertar, siendo hecho el diagnóstico de SQTL. La probanda de la Familia B (Figura 1B, paciente B2.1) presentaba 42 años y episodios de presíncope durante esfuerzos físicos. La misma buscó atención médica y recibió el diagnóstico de SQTL después de que su prima (#B2.9) presentó un episodio de muerte súbita abortada (MSA) en ambiente hospitalario. Los ECGs con medidas del intervalo QT de las probandas están mostrados en la Figura 2. La paciente A2.21 presentaba QT_C = 560 ms (Figura 2A) y la paciente B2.1 QT_C = 551 ms (Figura 2B). En la historia familiar de la probanda A2.21 era posible identificar 10 casos de muerte súbita en edades precoces, compatibles con SQTL. (Figura 1A, destacado en verde). En la Familia B había solamente un caso de MSA (#B2.9).

 

 

Los datos clínicos y electrocardiográficos de los individuos de ambas familias están presentados en la Tabla 1. La Familia A totalizaba 9 mujeres y 2 hombres, con edad entre 14 y 80 años. La Familia B contenía 17 individuos (7 del sexo masculino), con edades entre 5 meses y 69 años. Pueden ser identificados 8 individuos con Escore de Schwartz > 4, cuatro en la Familia A (A2.21, A2.23, A3.2, A3.3) y 4 en la Familia B (B1.1, B2.1, B2.9, B3.1). Dos de esos individuos (A2.21 y B2.9) presentaron episodios de muerte súbita abortada (MSA) y fueron tratados con CDI + betabloqueante. Los demás (A1.10, A2.23, A3.2, A3.3, B1.1) eran asintomáticos y fueron tratados con betabloqueantes aisladamente. Uno de los casos de MSA (B2.9) presentaba intervalo QT_C = 448 ms, entre tanto, este ECG fue registrado en la vigencia del tratamiento con betabloqueante, que puede reducir el intervalo QT. Apenas un individuo (A1.10) presentaba probabilidad intermedia de SQTL (Escore de Schwartz = 2,5) y QT_C limítrofe (450 ms). El análisis del heredograma sugirió que ese individuo debería ser portador de mutación causante de SQTL, lo que fue confirmado por el análisis molecular. Apenas un individuo (A2.21) presentaba registro de Torsades de Pointes.

El análisis molecular fue capaz de detectar variaciones previamente descriptas del gen KCNH2 en las probandas de ambas familias. En la probanda de la Familia A fueron identificadas las variantes génicas A1692G y G1714A, ambas en el exón 8. En la probanda de la Familia B fueron identificadas las variantes génicas C1467T, C1600T, A1692G y T1956C. Todas las variantes encontradas son polimorfismos de único nucleótido (SNPs) y las pacientes son heterocigotas en todos los loci. Entre tanto, las variantes génicas G1714A (Familia A) y C1600T (Familia B), ambas en el exón 8 del gen KCNH2, son SNPs del tipo no sinónimo (missence) y fueron previamente descriptas como asociadas a la SQTL. La identificación de esas variantes génicas es destacada en la Figura 3. Las otras variantes encontradas son polimorfismos comunes y sin relevancia clínica demostrada¹².

Las variantes missence G1714A y C1600T fueron investigadas en los familiares de los probandos A2.21 y B2.1, respectivamente. Los resultados de ese genotipaje están presentados en las Figuras 1A y 1B. En la Familia A el QT_C medio en los portadores de la variante génica era de 521 ± 42 ms, comparado a un QT_C medio de 391 ± 21 ms en los no portadores. En la Familia B la media del intervalo QT_C en los portadores de la variante era de 497 ± 42 ms, comparado con un QT_C medio de 404 ± 29 ms en los no portadores. Se observa, por lo tanto, que todos los portadores de los alelos G1714A y C1600T presentan prolongación del intervalo QT_C, confirmando la relevancia clínica de las variantes encontradas.

Discusión

En este trabajo realizamos el secuenciamiento completo de las regiones codificantes de los genes KCNQ1, KCNH2 y SCN5A buscando identificar las variantes génicas asociadas a la SQTL en dos familias conteniendo miembros diagnosticados con la enfermedad. A pesar de que la selección de variantes génicas en la SQTL frecuentemente es hecha utilizando la técnica de SSCP (single strand conformation polymorphism), que requiere mayor trabajo manual y presenta sensibilidad inferior a la de secuenciamiento.

Las dificultades de implementación en rutina de un método diagnóstico molecular de alta complejidad como la del SQTL nos llevaron a desarrollar, utilizando el software Geneious Pro^®, una secuencia de pasos para identificar con precisión mutaciones nuevas y ya descriptas. Los recursos de manipulación y anotación de secuencias de ese software fueron explorados para la construcción de mapas de mutación indicando los lugares con mutaciones descriptas, permitiendo el alineamiento de las secuencias de los diferentes genes obtenidas de los pacientes con los mapas de los genes KCNQ1, KCNH2 y SCN5A construidos, facilitando la identificación de diferencias entre ambas secuencias. El alineamiento realizado en ese programa permite, aun, eliminar artefactos de secuenciamiento. En el caso de que una variante génica encontrada haya sido previamente descripta como asociada a la SQTL, la referencia bibliográfica de la misma estará prontamente disponible en las marcaciones del mapa. Además de eso, el programa organiza los archivos internamente en un sistema de carpetas, de modo que los diversos archivos de secuencia originales quedan centralizados e indexados, lo que es crucial cuando se toma en cuenta el enorme volumen de información generada para cada paciente. De esa forma, la metodología desarrollada permite el análisis de las secuencias de manera eficiente y de fácil manejo, reduciendo la posibilidad de errores de interpretación y posibilitando el entrenamiento técnico de personal para la futura implementación de rutina de esa metodología para la red SUS.

La metodología de análisis molecular por nosotros establecida fue capaz de identificar variantes génicas previamente asociadas a la enfermedad en dos familias seleccionadas por los criterios clínicos ya definidos. Ambas familias investigadas presentaron variantes asociadas a la SQTL en el gen KCNH2, lo que permitió clasificar ambas pacientes como portadoras de SQTL tipo 2. Ese gen codifica la subunidad alfa del canal de potasio K_V11.1, responsable por la corriente I_Kr en el potencial de acción cardíaco²⁶. La variante G1714A encontrada en la Familia A ya fue previamente descripta²⁷ como asociada a la SQTL, y provoca la substitución del aminoácido glicina por serina en la posición 572 de la proteína, correspondiente al poro. Entre tanto, las consecuencias electrofisiológicas de la mutación en la actividad del canal iónico aun no fueron investigadas. La presencia de la variante génica G1714A en la familia aquí descripta refuerza la evidencia en favor de la patogenicidad de esa alteración. La variante génica C1600T, encontrada en la Familia B, provoca el intercambio del aminoácido arginina por cisteína en la posición 534 del polipéptido, correspondiente al sensor de voltaje del mismo canal iónico²⁸. Además de eso, en contraste a la variante anterior, los efectos de esa alteración fueron investigados electrofisiológicamente por Nakajima et al²⁹, que demostraron reducción del umbral de activación del canal, aceleración de la activación e inactivación, y reducción de la inactivación del canal en reposo.

Curiosamente, el genotipo identificado fue el del subtipo 2 - el segundo más frecuente, respondiendo por cerca de 30% de los casos. Por otro lado, aunque esas familias fuesen portadoras del mismo subtipo, y de que las variantes génicas están bastante próximas (en el mismo exón, inclusive), la presentación clínica de la enfermedad difería entre las mismas, tal vez debido a alteraciones en diferentes regiones del canal iónico. La asociación entre la región alterada en la estructura de la proteína, y la gravedad de la enfermedad fue investigada por Moss et al¹⁹. Los autores demostraron que las mutaciones en la región del poro del canal codificado por el gen KCNH2 están asociadas a un riesgo muy aumentado - cerca de 3 veces mayor - de eventos arritmogénicos. Un estudio de Shimizu et al³⁰ obtuvo resultados similares. En conformidad con esos trabajos, observamos una gravedad mucho mayor de la enfermedad en la Familia A (mutación en la región S5-Poro) que en la Familia B (mutación en el segmento transmembrana S4 - sensor de voltaje). Entre tanto, otro factor descripto que resulta en mayor gravedad en la presentación clínica es la presencia de más de una mutación causante de SQTL (compound mutations), que ocurre en cerca de 2% de los casos³¹. Como no fueron investigadas las variantes génicas en los genes menos frecuentemente asociados a la SQTL (SQTL tipos 4-12), no podemos excluir la posibilidad de que la Familia A sea un caso de ese tipo.

Fueron encontrados portadores asintomáticos, pero no portadores silenciosos con ECG normal. Portadores silenciosos son descriptos en la SQTL^4,5,32, siendo más comunes en la SQTL1¹⁴. El individuo A1.10 es ilustrativo de la complejidad de la enfermedad: aunque sea portador de la variante asociada a la enfermedad, su electrocardiograma muestra una prolongación apenas limítrofe del intervalo QT_C (450 ms) y su Escore de Schwartz es igual a 2,5. Diversos factores pueden influenciar el intervalo QT - algunas enfermedades, las concentraciones séricas de iones calcio y potasio y diversos medicamentos - y de esa forma pueden influenciar en la presentación de la SQTL. Además de eso, algunos trabajos recientes demostraron que polimorfismos comunes en genes de receptores adrenérgicos cardíacos son capaces de modular la duración del intervalo QT y la gravedad de la presentación clínica entre portadores de la misma mutación en el gen KCNQ1³³. Por lo tanto, la investigación de variantes génicas en la SQTL puede auxiliar en la identificación de portadores asintomáticos con el intervalo QT limítrofe, y puede ser útil al aconsejamiento genético.

Conclusión

Fue realizada la investigación molecular de dos familias con diagnóstico clínico de SQTL, han sido encontradas dos variantes génicas distintas previamente asociadas a la enfermedad. Fue implementada metodología de amplificación y secuenciamiento de la región codificante completa de los genes KCNQ1, KCNH2 y SCN5A, y desarrollado método computacional simplificado de análisis de las secuencias para la investigación de las variantes génicas utilizando recursos del software Geneious Pro^®, que facilita el entrenamiento de personal técnico para la futura aplicación de esa metodología en la rutina diagnóstica.

Potencial Conflicto de Intereses

Declaro no haber conflicto de intereses pertinentes.

Fuentes de Financiación

CNPq financió el presente estudio y FAPERJ financió parcialmente.

Vinculación Académica

Este artículo forma parte de Disertación de Maestría de Ernesto Curty, por la Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Rio de Janeiro.

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Investigación de variantes génicas de canales iónicos en pacientes con síndrome del QT largo

Ernesto Curty^I; Fernando Eugênio dos Santos Cruz^II; Fabiane Santos Lima^I; Jorge Luiz Albuquerque Coutinho^II; Rosane Silva^III; Turán Peter Ürményi^III; Antônio Carlos Campos Carvalho^II,III; Edson Rondinelli^I,III

Fechas de Publicación

• Publicación en esta colección
  04 Feb 2011
• Fecha del número
  Mar 2011

Histórico

• Revisado
  23 Ago 2010
• Recibido
  23 Ago 2010
• Acepto
  24 Set 2010