Metformina sinergicamente potencializa os efeitos antiproliferativos de cisplatina e etoposídeo em linhagem de células de câncer humano de pulmão NCI-H460

Resumos

OBJETIVO:

Testar a eficácia da combinação terapêutica de antineoplásicos convencionais (cisplatina e etoposídeo) com metformina em linhagem celular NCI-H460 de câncer de pulmão não pequenas células, a fim de desenvolver novas possibilidades terapêuticas com eficácia superior e reduzida toxicidade.

MÉTODOS:

Foi utilizado o ensaio de brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT) e calculado o índice de combinação dos fármacos estudados.

RESULTADOS:

Observamos que o uso de metformina em monoterapia reduziu a viabilidade celular metabólica da linhagem de células estudada. O uso de metformina em combinação com cisplatina ou etoposídeo foi sinérgico e superior à monoterapia com cisplatina ou etoposídeo.

CONCLUSÕES:

A metformina, devido às suas ações independentes em liver kinase B1, apresentou atividade antiproliferativa na linhagem NCI-H460 e, em combinação com cisplatina ou etoposídeo, ampliou a taxa de morte celular.

Carcinoma pulmonar de células não pequenas; Quimioterapia combinada; Metformina

OBJECTIVE:

To test the effectiveness of combining conventional antineoplastic drugs (cisplatin and etoposide) with metformin in the treatment of non-small cell lung cancer in the NCI-H460 cell line, in order to develop new therapeutic options with high efficacy and low toxicity.

METHODS:

We used the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay and calculated the combination index for the drugs studied.

RESULTS:

We found that the use of metformin as monotherapy reduced the metabolic viability of the cell line studied. Combining metformin with cisplatin or etoposide produced a synergistic effect and was more effective than was the use of cisplatin or etoposide as monotherapy.

CONCLUSIONS:

Metformin, due to its independent effects on liver kinase B1, had antiproliferative effects on the NCI-H460 cell line. When metformin was combined with cisplatin or etoposide, the cell death rate was even higher.

Carcinoma, non-small-cell lung; Drug therapy, combination; Metformin

Introdução

O câncer de pulmão (CP) é a neoplasia mais frequente e mortal na população mundial.^{( 1 )} No Brasil, o CP encontra-se entre os cinco tipos de câncer mais incidentes, segundo estimativas para 2012, e é o que mais fez vítimas entre os brasileiros em 2010.^{( 2 )} De posse desses dados, torna-se evidente que o CP é um desafio à saúde brasileira e mundial. Sabe-se que 85% de todos os casos de CP são classificados como CP não pequenas células (CPNPC), grupo composto por diferentes tipos histológicos, como adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas e carcinoma de células grandes, porém similares quanto a suas características clinicopatológicas.^{( 3 , 4 )}

A quimioterapia é utilizada em pacientes nos estádios III e IV a fim de ampliar a sobrevida, controlar a doença e melhorar a qualidade de vida. ^{( 5 )} Em geral, os derivados de platina, tais quais a cisplatina e a carboplatina, cumprem bem esse papel quando associados a antineoplásicos de terceira geração, como, por exemplo, o etoposídeo. ^{( 6 )} Inquestionavelmente, a combinação terapêutica é vantajosa no tratamento do câncer, posto que possibilita afetar múltiplos alvos moleculares, com aumento da eficácia terapêutica, redução das dosagens e consequente redução de toxicidade, assim como redução ou retardo na aquisição de fenótipos de resistência.^{( 7 )}

Nesse cenário, surge a metformina, uma biguanida amplamente utilizada como primeira linha de tratamento para pacientes com diabetes mellitus tipo 2.^{( 8 )} No entanto, desde a década de 1970, Dilman sugere o uso das biguanidas antidiabéticas como protetores antienvelhecimento e antineoplásicos.^{( 9 )}

Nesse contexto, o objetivo do presente estudo foi determinar a ocorrência de aditamento, sinergismo ou antagonismo entre antineoplásicos utilizados na terapêutica de CPNPC e a metformina, em linhagem celular NCI-H460, no intuito de avaliar novas combinações terapêuticas para o tratamento dos CPNPC.

Métodos

Inicialmente, a linhagem de CPNPC NCI-H460, representante do grupo histológico de carcinoma de células grandes, foi cultivada a 37°C e 5% de CO₂ em meio RPMI-1640 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino (Gibco/Invitrogen, Grand Island, NY, EUA) e solução estabilizada de penicilina (100 UI/mL), estreptomicina (100 µg/mL) e 0,5% (p/v) de anfotericina B (Gibco/Invitrogen) até a subconfluência. Obtidos através de doação de colaboradores, a cisplatina (Incel, solução injetável 1 mg/mL; Laboratório Darrow, Areal, Brasil), o etoposídeo (Posidon, solução injetável 20 mg/mL; Piére, Buenos Aires, Argentina) e o cloridrato de metformina (Pharma Nostra, Rio de Janeiro, Brasil) foram diluídos em PBS 1×.

No teste de viabilidade celular metabólica in vitro, as células foram cultivadas na densidade de 7,5 x 10⁴ células/poço em placas de 96 poços e, após 24 h, tratadas com cada fármaco, de modo dose-dependente, por 24 h. Em seguida, removeu-se o meio, adicionou-se 15 µL de brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT; Sigma-Aldrich) a 5 mg/mL em cada poço, e as placas foram incubadas por 4 h. Enfim, adicionou-se 100 µL de DMSO p.a. (Vetec, Rio de Janeiro, Brasil) para a dissolução dos cristais de formazan. Desse modo, a produção de formazan pela atividade de succinato desidrogenase mitocondrial reflete a proporção de células vivas em processo de estresse oxidativo causado pelos fármacos em teste.^{( 10 )} Nesse experimento, os valores de absorbância obtidos dos poços das células não tratadas, ou seja, expostas somente ao meio RPMI-1640, representam 100% de viabilidade celular. A citotoxicidade in vitro foi determinada pelo cálculo estimado da dose da concentração inibitória de 50% da proliferação celular (CI₅₀) a partir da curva dose-resposta de cada fármaco, após o cálculo de viabilidade metabólica, avaliada através do ensaio de MTT (absorbância a 570 nm), utilizando um espectrofotômetro (MR-96ª; Bioclin, Belo Horizonte, Brasil). Vale ressaltar que os experimentos para a obtenção das curvas dose-resposta das monoterapias e estimativa do CI₅₀ foram realizados em quadruplicata em três experimentos independentes, enquanto os experimentos para a determinação do índice de combinação foram realizados em triplicata em três experimentos independentes. Ademais, a interação entre os fármacos foi avaliada através da análise do índice de combinação, cujo valor foi determinado utilizando a equação clássica do isobolograma de Chou e Talalay, através do programa CompuSyn, versão 1.0 (ComboSyn, Paragon, NJ, EUA).^{( 11 )} Nesse contexto, caso o valor resultante do índice de combinação seja superior a 1,1 considera-se uma relação de antagonismo; entre 0,9 e 1,1, o efeito da combinação é aditivo; e, abaixo de 0,9, a combinação é sinérgica. Quanto à análise estatística, a partir dos resultados do ensaio de MTT, a média e o desvio-padrão das absorbâncias foram calculados, ao passo que os CI₅₀ estimados foram calculados usando os programa GraphPad Prism, versão 5 (GraphPad Inc., San Diego, CA, EUA). Todos os dados de combinação foram expressos como média ± dp e analisados utilizando ANOVA de uma via seguido do pós-teste de Bonferroni com o auxílio do mesmo programa.

Resultados

Inicialmente, foram conduzidos os experimentos de viabilidade celular para determinar as concentrações de CI₅₀ da metformina, cisplatina e etoposídeo para a linhagem de carcinoma de células grandes, NCI-H460, conforme apresentado na Tabela 1.

Tabela 1
Doses da concentração inibitória de 50% da viabilidade celular metabólica dos fármacos testados na linhagem celular NCI-H460.

Fármacos	CI50 , mM
Cisplatina	0,19
Etoposídeo	0,37
Metformina	60,58

• ^CI50
  : concentração inibitória de 50%

Em seguida, de posse desses dados, cada um dos fármacos foi diluído a fim de se obter soluções em concentrações na faixa do CI₅₀, bem como abaixo e acima desse valor, e foram conduzidos os testes de combinação in vitro da metformina com a cisplatina e com o etoposídeo a fim de permitir o cálculo dos gráficos de dose-resposta pelo programa; no entanto, somente serão discutidos os dados mais relevantes. Os dados resultantes desses gráficos foram analisados estatisticamente e estão representados nas Figuras 1 e 2. Finalmente, os efeitos das combinações foram utilizados para o cálculo do índice de combinação, cujos resultados estão apresentados na Tabela 2.

Figura 1
Avaliação da atividade da metformina e cisplatina, em diferentes concentrações, em monoterapia e em combinação, na redução da viabilidade celular metabólica (VCM) sobre as células da linhagem celular NCI-H460.

Figura 2
Avaliação da atividade da metformina e etoposídeo, em diferentes concentrações, em monoterapia e em combinação, na redução da viabilidade celular metabólica (VCM) sobre as células da linhagem celular NCI-H460.

Tabela 2
Índices de combinação de metformina com cisplatina ou com etoposídeo em linhagem celular NCI-H460.

Concentração, mM			Índice de combinação
Metformina	Cisplatina	Etoposídeo
60,58	0,19	0,00	0,70
30,29	0,19	0,00	0,90
30,29	0,00	0,18	0,81
15,14	0,00	0,09	0,90

Conforme o observado nos resultados, a combinação de metformina (60,58 mM) com cisplatina (0,19 mM) demonstrou apresentar uma ação antiproliferativa superior à monoterapia com metformina (nas concentrações de 60,58 e 30,29 mM) ou cisplatina (0,09 mM). Ademais, as combinações de metformina (60,58 e 30,29 mM) com cisplatina (0,19 mM) apresentaram sinergismo. A combinação de metformina (30,39 mM) com etoposídeo (0,18 mM) foi superior na redução da viabilidade celular metabólica da linhagem testada quando comparada à monoterapia com etoposídeo (0,18 e 0,09 mM) e com metformina (30,29 e 15,14 mM). Além disso, as combinações de metformina e etoposídeo, nas doses de 30,39 mM e 0,18 mM, respectivamente, e de 15,14 mM e 0,09 mM, respectivamente, foram sinérgicas.

Discussão

Diversos estudos epidemiológicos apontam a atividade da metformina tanto na prevenção quanto no tratamento do câncer.^{( 12 - 15 )} Há, inclusive, estudos que apontam que a metformina é capaz de melhorar o tratamento e, por conseguinte, a sobrevida dos pacientes com CPNPC e diabetes submetidos à quimioterapia.^{( 16 )} Posto que a metformina tem segurança e uso bem estabelecidos desde seu primeiro teste clínico em 1957, seu uso como um potencial agente antineoplásico é, decerto, uma estratégia interessante.^{( 17 )}

Apesar de a ação citotóxica da metformina, observada no presente estudo, ter sido inferior à ação do etoposídeo e da cisplatina em até 200 vezes, conforme podemos observar pelas doses de CI₅₀, a metformina em monoterapia reduziu a viabilidade celular metabólica das células de carcinoma de células grandes. Todavia, em esquemas politerápicos, a metformina, nas concentrações de 60,58 e 30,29 mM em combinação com cisplatina na concentração de 0,19 mM, demonstrou um efeito superior e sinérgico quando comparado à metade da dose do CI₅₀ da cisplatina (0,09 mM). Por sua vez, a combinação de metformina (30,39 mM) e etoposídeo (0,18 mM) apresentou um efeito sinérgico e superior na redução da viabilidade celular metabólica da linhagem NCI-H460 ao uso monoterápico do etoposídeo, nas doses de 0,18 e 0,09 mM, e da metformina, nas doses de 30,29 e 15,14 mM. Em consonância com nossos resultados, estudos pré-clínicos indicam que a administração oral de metformina em combinação à quimioterapia é capaz de bloquear o crescimento tumoral e prevenir a recidiva, bem como permite a redução das doses de doxorrubicina utilizadas no tratamento.^{( 18 )}

Apesar de sua consolidação no tratamento de diabetes, os mecanismos pelos quais a metformina pode atuar na supressão tumoral ainda precisam ser mais bem elucidados. O principal mecanismo possível da ação das biguanidas está relacionado à sua capacidade de inibir o complexo I das mitocôndrias com consequente desequilíbrio energético, desencadeando a fosforilação da enzima AMP kinase (AMPK) dependente da liver kinase B1 (LKB1).^{( 19 , 20 )} A LKB1 é a principal reguladora, em condições de estresse energético, da AMPK; essa, por sua vez, é moduladora do crescimento celular e do metabolismo em condições de redução do ATP intracelular.^{( 21 , 22 )}

Perdas alélicas de LKB1 ocorrem em diversos tipos de câncer - entre estes, os CPNPC - principalmente em adenocarcinomas pulmonares. Ademais, acredita-se que a maior parte das mutações em LKB1 no CPNPC geram perda da função da proteína codificada.^{( 23 , 24 )} A linhagem celular de carcinoma de células grandes utilizada no presente estudo (NCI-H460) apresenta uma mutação do tipo nonsense no LKB1, que leva à ausência da expressão do seu produto proteico.^{( 24 )} É possível atestar, portanto, que os mecanismos de ação da metformina nessas células são independentes da atividade de LKB1. Shackelford et al. observaram que a fenformina, um dos membros do grupo das biguanidas, pode ser utilizada como um agente antineoplásico para tumores com deficiência em LKB1 por ocasionar apoptose possivelmente induzida por estresse metabólico.^{( 25 )} Dessa forma, sugere-se que um possível mecanismo para a ação da metformina e outras biguanidas em células tumorais deficientes em LKB1 seja a inibição do complexo I mitocondrial, que causa a indução de espécies reativas de oxigênio e consequente apoptose, devido a sua incapacidade de neutralizar eficientemente essas espécies.^{( 26 )}

Outra razão plausível para a ação antiproliferativa e sinérgica da metformina é a sua atividade preferencial em células-tronco tumorais, grupo de células da massa tumoral que pode relacionar-se à formação tumoral, manutenção da massa tumoral, recidiva e metástase. Devido a essas características, fármacos que atinjam seletivamente essas células são extremamente promissores, posto que junto à quimioterapia convencional, poderiam tornar o tratamento mais efetivo e impedir a recidiva da doença.^{( 27 )} Hirsch et al. observaram que, em modelos xenográficos, a metformina inibe a proliferação, de forma preferencial, de células tumorais com fenótipo de células-tronco.^{( 26 )}

Em suma, o presente estudo apontou, pela primeira vez, que a metformina apresenta atividade antiproliferativa em uma linhagem de carcinoma de células grandes (NCI-H460) e, em combinação com cisplatina ou etoposídeo, age sinergicamente, ampliando a taxa de morte celular. Entretanto, ainda são necessários estudos mais amplos no intuito de elucidar melhor os mecanismos envolvidos.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  Nov-Dec 2013

Histórico

• Recebido
  28 Jul 2013
• Aceito
  22 Out 2013